固表止嚏湯調控Th17細胞/Treg抗變應性鼻炎作用機制

楊世珍 郭兆剛 蔡亞梅 龔艷

摘要：固表止嚏湯是云南省名中醫郭兆剛教授治療過敏性鼻炎的有效驗方，由生黃芪、白術、防風、荊芥、麻絨、紫蘇葉、蒼耳子、五味子、烏梅、黃芩、甘草為基本方組成。導師郭教授認為鼻鼽在臨床上肺氣虛寒者較多，強調調節陰陽，重在益氣固表，祛風通竅，自擬固表止嚏湯。通過構建變應性鼻炎模型，研究固表止嚏湯通過調控Th17細胞/Treg平衡介導抗變應性鼻炎的作用機制。

關鍵詞：固表止嚔湯、變應性鼻炎，Th17細胞，Treg

中圖分類號：R765.21 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2023）09-0001-03

Discussion on the Action Mechanism of Exterior-strengthening and Sneeze-stoppingDecoction by Regulating Th17 Cells/Treg Against Allergic Rhinitis

YANG Shi-Zhen1， GUO Zhao-gang2， CAI Ya-Mei1， GONG Yan1

（1. Traditional Chinese Medicine Hospital of Yuxi City， Yuxi 653100， China;2. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China）

【Abstract】Exterior-strengthening and Sneeze-stopping Decoction is an effective prescription for the treatment of allergic rhinitis by Professor Guo Zhaogang， a famous Chinese medicine doctor in Yunnan Province， which is composed of raw astragalus， atractylodis， saposhnikovia， schizopeta， ephedra， perilla leaves， cocklebur， schisandra， mume， scubaicalensis and licorice. Professor Guo considers that allergic rhinitis is more qi deficiency and cold in lung clinically， emphasizing the regulation of yin and yang， stressing on tonifying qi and strengthening exterior， dispelling wind to clear apertures， thus making self-prescribed Exterior-strengthening and Sneeze-stopping Decoction. By constructing the model of allergic rhinitis， the study aims at the mechanism of antiallergic rhinitis mediated by the regulation of Th17 cell /Treg balance.

【Key words】Exterior-strengthening and Sneeze-stopping Decoction; Allergic Rhinitis; Th17 Cells; Treg

變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是耳鼻咽喉科臨床的一個常見病、多發病，是特應性個體接觸了致敏原后由IgE介導的介質釋放、并有多種免疫活性細胞和細胞因子等參與的鼻黏膜慢性炎癥反應性疾病［1］。變應性鼻炎因其不斷增高的發病率越來越得到醫學界的重視，已被列入國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）［2］。研究已表明，在變應性鼻炎患者的外周血中，Treg細胞的數量減少，而Th17細胞的數量增加，Treg/Th17細胞失衡與AR發生密切相關。因此如何維持Treg/Th17細胞亞群間的平衡和自身內環境穩定，已成為治療AR重要的藥物靶點［3］。中醫認為AR應歸于“鼻鼽”，治療上，遵循中醫整體觀念和辨證論治理論，調整臟腑陰陽平衡，改善患者的過敏體質，調節機體免疫功能，控制變態反應的發生，目前中藥治療已取得了顯著療效。臨床上肺虛感寒、肺脾氣虛、腎陽虧虛等為常見的臨床證型［4］。固表止嚏湯選由具有抗變態反應作用的藥物組方，方中所選藥物，現代藥理研究認為，都具有抗變態反應的作用，它們在變態反應的不同環節中發揮不同程度的作用［5］。

1 研究內容

采用卵清蛋白（OVA）+氫氧化鋁粉基礎致敏+強化致敏構建變應性鼻炎模型，固表止嚏湯藥物干預后，通過變應性鼻炎癥狀評分表評價固表止嚏湯抗變應性鼻炎效應，HE染色評價固表止嚏湯對變應性鼻炎組織病理損傷的影響。酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測血清中IL-10、TGF-β和IL-17水平；實時定量PCR檢測與分析鼻粘膜和脾淋巴細胞Th17相關基因（IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-23、RORγt和CCR6）和Treg細胞相關基因表達水平；流式細胞術（FACs）檢測Th17和Treg細胞的表達水平。

2 材料與方法

2.1 實驗動物 來源，種系，品系：BALB/c小鼠，7～8周齡，體重20～22g，雌性，斯貝福（北京）生物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2019-0010；動物飼養在SPF級動物房，實驗動物至少飼養一周后使用。溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，12 h光暗循環。飼料和水均在消毒后由動物自由攝取。所有實驗均嚴格按照實驗動物有關條例進行。

2.2 固表止嚏湯浸膏的制備 固表止嚏湯，由生黃芪、白術、防風、荊芥、麻絨、紫蘇葉、蒼耳子、五味子、烏梅、黃芩、甘草為基本方組成，所需藥材加水浸泡1h，煮沸2次，每次30min，過濾后并濃縮，折合原藥材1 g浸膏相當于原藥材2.6 g生藥。

2.3 實驗材料 主要試劑如表1。

2.4 主要儀器設 主要實驗儀器如表2。

3 實驗方法及評價

3.1 變應性鼻炎模型的誘導、分組和給藥 60只BALB/C小鼠，隨機分為6組：正常組、模型組、陽性藥組（氯雷他定組）組、固表止嚏湯低、中、高劑量組，每組10只。采用卵清蛋白（OVA）+氫氧化鋁粉滴鼻構建變應性鼻炎模型，具體為：鼻腔滴藥后將100 μg卵清蛋白（OVA）和2mg氫氧化鋁粉AL（OH）3溶入0.1mL生理鹽水中，分別于第0、2、4、6、8、10、12、14天給予實驗組（AR組）小鼠腹腔注射，自第15-25天每日將50 mg OVA溶入10 mL生理鹽水中，滴鼻，每側鼻孔10 mL，連續滴鼻11d。對照組使用生理鹽水替代OVA同期進行腹腔注射以及滴鼻。第15天開始，固表止嚏湯低、中、高劑量組（7.5、15、30 g/kg），陽性藥組以氯雷他定組（0.5 mg/kg）每天灌胃給藥1次，共7 d，正常組和模型組灌胃等體積的生理鹽水，給藥量按照實驗動物與人用藥量的換算公式計算得出。

3.2 指標檢測

3.2.1 變應性鼻炎癥狀評分表 觀察鼻部癥狀如鼻癢、流清涕、打噴嚏等出現的情況及輕重，并按照表3記錄行為學得分。

3.2.2 鼻腔組織病理檢測 末次OVA激發給藥后，小鼠脫脊椎處死，鼻腔組織于4％多聚甲醛溶液中固定2h，石蠟包埋，切片，HE染色觀察鼻腔組織病理變化。

3.2.3 Th17和Treg細胞相關細胞因子的檢測 迅速摘眼球取血，3000 r/min離心10 min，分取上層血清，血清標本置于-20℃保存并立即送檢。酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測血清中TGF-β和IL-17水平，實驗方法詳見說明書。

3.2.4 熒光定量PCR檢測Th17和Treg相關基因得表達 取脾淋巴細胞1×107，應用Trizol試劑盒抽提細胞總RNA，采用超微量核酸蛋白檢測儀測定其濃度。按照逆轉錄試劑盒說明，采用RT-PCR法制備cDNA。逆轉錄所得的cDNA用作PCR反應的模板。取同一個cDNA為模板，按照試劑盒說明書，實時定量PCR進行Th17相關基因和Treg細胞相關基因mRNA表達檢測與分析，相關引物由Invitrogen公司合成。熒光定量PCR的結果以Ct值顯示。實時熒光定量PCR中每個樣本重復3次，取平均值為Ct值。

3.2.5 流式細胞術檢測Th1和Treg細胞的表達水平 對胞內細胞因子染色：各組1×106個小鼠脾淋巴細胞和淋巴結細胞與PMA、Ionomycin以及BFA于5%CO2培養箱中共培養4h后，收集細胞，冼液冼2次，加入IgG抗體，封閉FcR，行標志CD4染色。完畢后，固定、穿膜，加入熒光標記的抗IL-17抗體和IFN-g，流式細胞儀檢測分析。對于Treg細胞的檢測，無需上述刺激，按胞內細胞因子染色檢測，Flowjo軟件分析

3.3 統計學方法 所有實驗數據均采用統計學方法處理。均值間差異比較采用t檢驗或單因素方差分析，數據統計均以平均值±標準差表示，以P<0.05為顯著水平。數據統計分析采用SPSS17.0統計軟件包。

4 實驗結果

4.1 固表止嚏湯對變應性鼻炎模型體重的影響 表4結果顯示，與空白組比較，模型組小鼠體重下降，但差異無顯著性意義（P>0.05）；與模型組比較，陽性組和固表止嚏湯低、中、高劑量組小鼠體重無明顯差別（P>0.05）。見表4。

4.2 固表止嚏湯對變應性鼻炎癥狀評分的影響 表5結果顯示，與空白組比較，模型組小鼠癥狀評分顯著增加，差異具有顯著性意義（P<0.01）；與模型組比較，陽性組和固表止嚏湯低、中、高劑量組癥狀評分顯著減少，差異具有顯著性意義（P<0.05）。見表5。

4.3 固表止嚏湯對變應性鼻炎模型鼻黏膜組織病理的影響 與空白組比較，模型組小鼠鼻黏膜有大量炎癥細胞的浸潤，固有層腺體增生明顯，纖毛柱狀上皮細胞排列缺乏完整性。與模型組比較，陽性藥組和固表止嚏湯中、高劑量組鼻黏膜炎癥細胞的浸潤顯著減少，固有層腺體增生改善，纖毛柱狀上皮細胞排列較好，以陽性藥和固表止嚏湯中劑量效果最好。見圖1。

4.4 固表止嚏湯對變應性鼻炎模型血清細胞因子IL-17的影響 ELISA檢測結果顯示，與空白組比較，模型組小鼠血清IL-17水平升高，但差異無顯著性意義。與模型組比較，陽性藥組和固表止嚏湯低、中、高劑量組均低于模型組，其中中劑量差異具有顯著性意義（P<0.05）。見表6。

4.5 固表止嚏湯對變應性鼻炎模型小鼠血清細胞因子TGF-b的影響 ELISA檢測結果顯示，與空白組比較，模型組小鼠血清TGF-b水平無明顯變化，與模型組比較，固表止嚏湯高劑量組血清細胞因子TGF-b高于模型組，差異具有顯著性意義（P<0.05）。見表7。

4.6 固表止嚏湯對變應性鼻炎模型Th17/Th1細胞表達的影響 流式細胞術檢測變應性鼻炎模型小鼠脾臟和淋巴結Th17（CD4+IL-17+T細胞）和Th1細胞（CD4+IFN-g+T細胞）表達水平。結果顯示，與模型組比較，固表止嚏湯給藥組小鼠脾臟的CD4+IL-17+T細胞比例顯著下降，差異具有顯著性意義（P<0.05）。然而淋巴結2組Th17細胞表達無差異。2組小鼠淋巴結和脾臟Th1細胞表達水平均無顯著差異。結果見圖2。

4.7 固表止嚏湯對變應性鼻炎模型小鼠Treg細胞表達的影響 流式細胞術檢測變應性鼻炎模型小鼠脾臟和淋巴結Treg細胞（CD4+Foxp3+T細胞）表達，結果顯示，與模型組比較，固表止嚏湯藥物干預顯著上調變應性鼻炎模型小鼠脾臟和淋巴結Treg細胞比例，差異均具有顯著性意義（P<0.05）。結果見圖3。

5 小結

本研究結果證實，固表止嚏湯能夠顯著改善變應性鼻炎模型的炎癥評分和鼻黏膜的病理損傷，減少黏膜組織炎癥細胞的浸潤，其作用機制與抑制Th17細胞，上調Treg細胞的表達，調控Th17細胞/Treg平衡有關。

參考文獻：

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［5］沈映君.中藥藥理學［M］.北京：人民衛生出版社，2011.