紫蘇醛抑制黃曲霉生長機理研究

仝文君 張玉申 陳曉璐 雷瑤 周云靜 都立輝

摘要：研究分析了紫蘇醛對黃曲霉細胞壁的作用機理。通過對麥角固醇含量、掃描電鏡菌絲形態觀察、胞內物質外泄等指標的測定以及胞壁相關基因表達量的變化，確定紫蘇醛通過抑制黃曲霉細胞膜組分合成而破壞細胞膜完整性。結果表明：紫蘇醛對黃曲霉最小抑菌濃度為0.125 μL/mL；霉菌質膜中的麥角固醇含量由582.75 μg/g下降到281.85 μg/g；紫蘇醛處理后的黃曲霉菌體受損嚴重，孔洞與凹陷明顯，菌體變形；胞內物質大量外泄，霉菌細胞膜完整性降低。以上結果表明紫蘇醛通過抑制CYP51B、CHSB、CHSC等胞壁相關基因，抑制麥角甾醇合成，破壞質膜完整性，進而致使細胞膜滲透性被破壞，胞內物質外泄。

關鍵詞：紫蘇醛；黃曲霉；胞壁基因；抑菌機理

中圖分類號：Q939 文獻標志碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20230426

基金項目：江蘇省研究生科研與實踐創新計劃（KYCX21_1531）。

Study on mechanism of perillaldehyde inhibiting the growth of Aspergillus flavus

Tong Wenjun， Zhang Yushen， Chen Xiaolu， Lei Yao， Zhou Yunjing， Du Lihui

（College of Food Science and Engineering， Nanjing University of Finance and Economics， Nanjing， Jiangsu 210023）

Abstract： In this study， we analyzed the mechanism of perillaldehyde in Aspergillus flavus cell walls. By observing the contents of ergosterol， the morphology of mycelia under scanning electron microscope， the determination of intracellular substance leakage， and the changes of cell wall related gene expression， perillaldehyde was determined to inhibit A. flavus fine synthesis of membrane components destroying membrane integrity. The results showed that the minimum inhibitory concentration of perillaldehyde against A. flavus was 0.125 μL/mL. The ergosterol content in mycoplasma plasma membrane decreased from 582.75 μg/g to 281.85 μg/g. After perillaldehyde treatment， A. flavus was seriously damaged， with obvious holes and depressions， and the bacteria were deformed. A large amount of intracellular substances leaked out and the integrity of mold cell membrane was reduced. These results indicated that perillaldehyde inhibited ergosterol synthesis and damaged plasma membrane integrity by inhibiting CYP51B， CHSB， CHSC and other cell wall related genes， thus resulting in the destruction of membrane permeability and the leakage of intracellular substances.

Key words： perillaldehyde， Aspergillus flavus， cell wall gene， bacteriostasis mechanism

黃曲霉（Aspergillus flavus）作為在大量淀粉基質上生長的雜草狀霉菌[1]，污染了堅果、玉米、大豆、花生、稻谷等經濟作物。在糧食的生長、收獲、倉儲、加工、運輸等環節中，也會產生大量的致癌性劇毒化合物黃曲霉毒素（aflatoxin， AFT）[2]。該毒素除了降低糧食本身的營養價值，造成較大經濟損失以外，對動物和人體的健康也造成極大威脅[3]。黃曲霉毒素具有很強的誘導異常性、免疫抑制性和致癌性，肝臟損害是其致病性的主要表現[4]。機體的免疫受抑制，進而致使抗病力降低[5-6]。因此，控制黃曲霉的生長繁殖以及毒素的代謝累積，對保障儲糧安全與質量控制具有重要的社會意義。令人唏噓的是，盡管各種抑菌物質被廣泛用于抑制此類真菌的生長[7-8]，但耐藥菌株層出不窮，在毒性、高殘留、難降解和高成本等各方面仍然存在巨大的缺點[9-10]。因此，介于合成抗真菌劑的多重潛在耐藥性和副作用[11]，人們越來越關注天然抗真菌劑。植物來源的天然抗真菌劑以其廣譜抗菌性、生物可降解性、高揮發性和低殘留等特點已被認為是傳統化學抑菌劑的理想替代品[12-13]。

紫蘇醛作為紫蘇中提取的一種天然的單萜物質[14]，具有多種生物學特性，包括抗炎、抗真菌、抗感染、抗氧化、抗癌、抗過敏及降脂等生物學作用[15]。有研究[14，16]指出，紫蘇醛對絲狀真菌如黃曲霉菌、黑曲霉菌和白色念珠菌具有顯著的殺菌作用。故紫蘇醛在抑菌方面有廣闊的應用前景。近年來，真菌細胞壁因其在真菌胞壁完整性中的重要作用，其胞壁組分關鍵合成酶常被作為開發新型殺菌藥物的靶點被認為是開發新抗真菌治療的可能靶點[17]。石程仁等[18]發現0.2 mg/mL的紫蘇醛可抑制黃曲霉生長，并具有較高的抑制黃曲霉產毒能力。Tian等[19]發現紫蘇醛能夠通過抑制黑曲霉菌細胞壁麥角甾醇的合成發揮殺菌作用。因此有必要對紫蘇醛作用于黃曲霉的抑菌機理做進一步研究。

本實驗主要測定與黃曲霉細胞壁表型相關的麥角固醇、菌絲形態觀察、電導率等指標，并對與胞壁合成相關的葡聚糖合成酶、4種幾丁質合成酶等進行熒光定量，逐層遞進地研究紫蘇精油對黃曲霉菌細胞壁的作用機理，以期為進一步闡述紫蘇醛抑菌機理提供理論依據和新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：北京陸橋技術有限責任公司；馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）：上海博微生物科技有限公司。

乙醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；血球計數板：上海求精生化試劑儀器有限公司；紫蘇醛：上海源葉生物科技有限公司；戊二醛（分析純）、乙醇（分析純）、氫氧化鉀（分析純）、正庚烷（分析純）：阿拉丁試劑有限公司；鉀離子試劑盒：南京建成生物有限公司；反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒：諾唯贊生物科技有限公司。

AB104-N型電子天平：上海第二天平儀器廠；FE38型電導率儀：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；THZ-D型臺式恒溫振蕩器：上海百典儀器設備有限公司；GI54DP型立式高溫高壓滅菌鍋：致微公司；日立SU8020型掃描電鏡：日本日立公司；CJ-2D型超凈工作臺：上海三發科學儀器有限公司；Synergy H1型酶標儀：美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃曲霉菌孢子液制備

取純化后的野生型（WT）黃曲霉菌株接種在PDA培養基上，在30 ℃黑暗培養4～6 d后，使用滅菌后的孢子洗脫液進行洗脫收集，用血球計數板對孢子進行計數，終濃度調至1×106個/mL后備用。

1.2.2 最小抑菌濃度（MIC）

根據Rodriguez-Tudela等[20]的方法，采用二倍稀釋法測定紫蘇醛的MIC。以不出現肉眼可見菌落的最低抑菌濃度定義為MIC。

1.2.3 麥角固醇含量測定

1.2.4 掃描電鏡觀察

參考Ju等[22]的方法略作修改。2%孢子液接種至含有不同濃度（0、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC）紫蘇醛的PDB培養基，30 ℃，160 r/min培養48 h，取適量菌絲體，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽（PBS，pH 7.2）洗滌并收集菌絲體。2.5%戊二醛固定2 h，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗3次，梯度乙醇系列脫水干燥后，進行噴金鍍膜處理，10.0 kV下用掃描電鏡觀察菌絲體形態特征。

1.2.5 細胞膜滲透性測定

根據Bomfin等[23]的測定方法稍加修改，采用電導率來表示滲透率的變化。2%孢子液接種至PDB，30 ℃、160 r/min培養48 h，抽濾得菌絲體。配制含有1/2 MIC、1 MIC、2 MIC紫蘇醛的無菌水，對照組為不添加紫蘇醛的無菌水。取1 g菌絲置于30 ℃、120 r/min培養12 h，間隔2 h取樣。用電導率儀測定黃曲霉的電導率。

1.2.6 紫蘇醛對黃曲霉菌絲K+泄露的影響

2%孢子液接種至PDB，30 ℃、160 r/min培養48 h，抽濾得菌絲體。配制含有1/2 MIC、1 MIC、2 MIC紫蘇醛的無菌水，對照組為不添加紫蘇醛的無菌水。取1 g菌絲置于30 ℃、120 r/min培養12 h，間隔3 h取樣。用鉀離子試劑盒測定K+ 的含量。

1.2.7 RNA提取與熒光定量PCR（qRT-PCR）

取不同紫蘇醛濃度處理的菌株（1/4 MIC、1/2 MIC和3/4 MIC）培養48 h，以不添加紫蘇醛培養24 h的黃曲霉作為對照組。取液氮研磨后的菌體100 mg，加1 mL Trizol，勻漿處理，提取菌株RNA，超微量分光光度計測定提取RNA的純度和質量。用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA。用熒光定量PCR儀檢測相關基因相對表達量。

1.3 數據處理

每組實驗重復3次，實驗結果以平均值±標準差表示，采用SPSS 17.0進行數據處理與分析，通過鄧肯檢驗進行單因素方差分析，顯著性差異P<0.05。

2 結果與分析

2.1 最小抑菌濃度

如圖1所示，不添加紫蘇醛的野生型對照組，孢子正常萌發，芽管延伸，基本生長成菌絲體狀；紫蘇醛濃度較低（0.031 25～0.125 μL/mL）時，隨紫蘇醛濃度的升高，黃曲霉孢子芽管長度逐漸變短，交聯不再致密，萌發被抑制；蘇醛濃度為0.25、0.5 μL/mL時，孢子不再萌發。表明黃曲霉的MIC為0.125 μL/mL。

2.2 麥角固醇含量測定

黃曲霉經0、0.031 25、0.062 5、0.125 μL/mL的紫蘇醛處理后，其麥角固醇含量如圖2所示，處理組麥角固醇含量較對照組的顯著降低（P <0.05），且隨著紫蘇醛濃度的增加，菌體麥角固醇含量逐漸降低。麥角固醇是霉菌細胞壁的主要成分，是評價細胞膜完整性的重要指標。麥角固醇的合成受阻將會導致細胞膜功能的顯著障礙，使胞內物質泄露。Ferreira等[24]研究表明，麥角甾醇大多具有抑制麥角甾醇生物合成的作用，會損害蛋白質的完整性和功能，導致滲透紊亂，從而影響真菌生長和增殖。李汶玥等[25]研究發現，二氧化氯及丁香肉桂精油均會影響禾谷鐮刀菌細胞膜的完整性，麥角固醇含量同樣出現了被抑制的現象，導致細胞膜滲透性增強，從而抑制菌絲生長。由此可知，紫蘇醛通過破壞霉菌細胞壁的主要成分麥角固醇抑制黃曲霉生長，且這種抑制具有濃度依賴性。

2.3 掃描電鏡觀察

由圖3可知，未經紫蘇醛處理的菌絲形態完整，菌絲整齊、均勻、表面光滑。而用0.031 25 μL/mL紫蘇醛處理的菌絲，表面變得不平整，部分產生褶皺與變形，0.062 5 μL/mL紫蘇醛處理的菌絲體，出現大量孔洞與凹陷，當濃度增加到0.125 μL/mL時，菌絲體損傷更嚴重，甚至出現斷裂。呂好新等[26]研究了肉桂-山蒼子復合精油對黑曲霉的影響，證實精油處理的黑曲霉BQM菌絲體損傷嚴重，發生皺縮、干癟、凹陷等變形現象。陳可欣等[27]研究表明，香樟精油處理后的灰綠曲霉細胞變形嚴重，霉菌表面明顯受損，精油處理會改變灰綠曲霉細胞的完整性與膜滲透性。由此推測，隨著紫蘇精油處理濃度的增加，菌絲體形態被嚴重破壞，細胞膜完整性喪失引起細胞膜結構嚴重受損，菌絲體內含物流出導致黃曲霉菌生長受阻。

2.4 細胞膜滲透性測定

在0～10 時內，對照組未檢測到明顯變化，而經不同濃度紫蘇醛處理的黃曲霉，電導率表現出了不同的增加趨勢（圖4（a）），電導率隨著時間的推移，逐漸升高，呈正相關性。暴露12 h后，0.031 25、0.062 5、0.125 μL/mL紫蘇醛處理組的電導率分別升至（170.6±6.53）、（238.6±6.01）、（269.1±9.98） μS/cm，顯著高于對照組。此現象與Hu等[28]的研究結果一致。這表明高濃度的紫蘇醛會導致細胞內成分泄漏和電解質流出，使電導率顯著升高。

在0～12時，不同濃度紫蘇醛處理后的菌體的K+外泄濃度與對照組相比，均表現出明顯差異（圖4（b）），尤以1 MIC和2 MIC最為顯著。其中菌體在紫蘇醛處理后的3～9 h，K+含量上升趨勢最為明顯。劉歡等[29]研究發現復配精油破壞菌絲細胞膜結構，內部的K+、Na+等離子流出，且隨著精油濃度增加，細胞溶出物的釋放量和細胞膜滲透性明顯增加。蔣夢曦等[30]發現，Iturin A處理能使緩沖液中K+離子濃度顯著增加，表明Iturin A對匍枝根霉菌絲的細胞膜造成一定破壞，使得細胞膜上形成孔洞，胞內物質外泄。這表明高濃度的紫蘇醛能在更短時間內對黃曲霉菌絲細胞膜造成破壞，且破壞程度劇烈，致使K+濃度急劇增加。其菌體細胞膜受到了不可逆的損傷。

本研究中電導率和電解液泄漏的增加證實菌體自身保護屏障被打破，紫蘇醛通過破壞細胞膜完整性對黃曲霉造成不利影響。

2.5 熒光定量PCR

經紫蘇醛處理的黃曲霉的麥角固醇（CYP51B）和4種幾丁質酶（CHSB、CHSC、CHSE、CHSG）表達下調，較對照組（CK）均顯著降低（圖5）。CYP51B基因的差異表達證實了紫蘇醛處理降低了黃曲霉細胞膜中甾醇的生物量，4種幾丁質酶的差異表達也證明了紫蘇醛處理破壞了黃曲霉細胞壁的完整性。

3 結 論

本研究通過對麥角固醇含量、掃描電鏡菌絲形態觀察、胞內物質外泄等指標的測定以及胞壁相關基因表達量的變化，確定紫蘇醛通過抑制黃曲霉細胞膜組分合成而破壞細胞膜完整性。采用二倍稀釋法，測定了紫蘇醛對黃曲霉的最小抑菌濃度為0.125 μL/mL；紫蘇醛處理能夠抑制菌絲麥角固醇的合成，導致黃曲霉菌絲內部電解液以及K+的外泄，細胞膜滲透性增強，從而抑制菌絲生長；掃描電鏡觀察表明，紫蘇醛處理使黃曲霉菌體損傷嚴重，形成大量孔洞與凹陷。紫蘇醛處理后的CYP51B以及4種幾丁質酶基因表達量顯著降低，與上述表型結果具有一致性。

本研究發現，紫蘇醛通過調節黃曲霉胞壁相關基因的表達進而影響麥角甾醇的合成，破壞質膜完整性，進而致使細胞膜滲透性被破壞，胞內物質外泄，影響多種酶進行正常的合成和代謝，使菌體代謝受阻。

參 考 文 獻

[1] GONG Q W， ZHANG C， LU F X， et al. Identification of bacillomycin D from Bacillus subtilis fmbJ and its inhibition effects against Aspergillus flavus[J]. Food Control，2014，36（1）：8-14.

[2]張少波，鄧常繼，張海濤，等.時間分辨熒光免疫層析法測定糧食中的黃曲霉毒素B1[J].糧食科技與經濟，2021，46（6）：80-82+110.

[3]戴煌，黃周梅，李占明，等.免疫法在食品黃曲霉毒素檢測中的應用[J].中國食品報，2021，21（10）：287-304.

[4]高曉芳，胡婷婷，洪冰，等.超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定小麥中黃曲霉毒素B1[J].糧食科技與經濟，2022，47（1）：85-87+91.

[5]李敬璽，歐陽素貞，王學平.黃曲霉毒素對機體的損害與硒的保護作用[J].河南職業技術師范學院學報，2003（2）：50-54.

[6]白海娜.食品中黃曲霉毒素研究進展[J].食品安全導刊， 2020（33）：154.

[7]胡春紅，李俐俐，劉坤，等.食品防腐劑對產毒黃曲霉孢子萌發及菌絲生長的抑制作用研究[J].食品工業科技，2014，35（15）：282-285.

[8]林日高，林捷，周愛梅，等.對羥基苯甲酸酯類鈉鹽的抑菌作用及其穩定性研究[J].中國食品添加劑，2002（3）：19-23.

[9]翟秀超，馮文旭，吳殿輝，等.植物精油對真菌微生物抑制作用的研究進展[J].食品與發酵工業，2021，47（6）：259-266+279.

[10]郭東起.拮抗酵母菌在果蔬采后保鮮中的應用[J].食品研究與開發，2016，37（8）：4.

[11]王龑，林威，俞根榮，等.植物精油在食品防霉保質中應用的研究進展[J].核農學報，2021，35（5）：1170-1177.

[12]鄧業成，寧蕾.4種植物精油的抑菌活性及應用[J].廣西師范大學學報（自然科學版），2012，30（3）：288-294.

[13] JULIANY R C， PHILIP G C， CORLISS A O， et al. Essential oils as antimicrobials in food systems – a review[J]. Food Control，2015，54：111-119.

[14] TIAN H， QU S， WANG Y Z， et al. Calcium and oxidative stress mediate perillaldehyde-induced apoptosis in Candida albicans[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2017，101（8）：3335-3345.

[15] QU S， CHEN L， TIAN H， et al. Effect of perillaldehyde on prophylaxis and treatment of vaginal candidiasis in a murine model[J]. Frontiers in Microbiology，2019，10：1466.

[16] TIAN J， WANG Y Z， LU Z Q， et al. Perillaldehyde， a promising antifungal agent used in food preservation， triggers apoptosis through a metacaspase-dependent pathway in Aspergillus flavus[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2016，64（39）：7404-7413.

[17] CORTéS J C G， CURTO M A， CARVALHO V S D， et al. The fungal cell wall as a target for the development of new antifungal therapies[J]. Biotechnology Advances，2019，37（6）：107352.

[18] 石程仁，張初署，杜詠梅，等.不同植物抑制劑對黃曲霉菌生長和產毒的影響[J].食品安全質量檢測學報，2017，8（8）： 2892-2897.

[19] TIAN J， WANG Y Z， ZENG H， et al. Efficacy and possible mechanisms of perillaldehyde in control of Aspergillus niger causing grape decay[J]. International Journal of Food Microbiology，2015，202：27-34.

[20] RODRíGUEZ-TUDELA J L， BARCHIESI F， BILLE J， et al. Method for the determination of minimum inhibitory concentration （MIC） by broth dilution of fermentative yeasts[J]. Clinical Microbiology and Infection，2003，9（8）：i-viii.

[21] AVAN？O G B， FERREIRA F D， BOMFIM N S， et al. Curcuma longa L. essential oil composition， antioxidant effect， and effect on Fusarium verticillioides and fumonisin production[J]. Food Control，2017，73：806-813.

[22] JU J， XU X M， XIE Y F， et al. Inhibitory effects of cinnamon and clove essential oils on mold growth on baked foods[J]. Food Chemistry，2018，240：850-855.

[23] BOMFIM N D S， NAKASSUGI L P， OLIVEIRA J F P， et al. Antifungal activity and inhibition of fumonisin production by Rosmarinus officinalis L. essential oil in Fusarium verticillioides （Sacc.） Nirenberg[J]. Food Chemistry，2015，166：330-336.

[24] FERREIRA F M D， HIROOKA E Y， FERREIRA F D， et al. Effect of Zingiber officinale roscoe essential oil in fungus control and deoxynivalenol production of Fusarium graminearum Schwabe in vitro[J]. Food Additives & Contaminants： Part A， Chemistry， Analysis， Control， Exposure & Risk Assessment，2018，35（11）：2168-2174.

[25] 李汶玥，陳虹宏，袁永俊，等.二氧化氯及丁香、肉桂精油對禾谷鐮刀菌生長和孢子萌發的抑制研究[J].糧油食品科技，2022，30（2）：197-206.

[26] 呂好新，趙玲麗，霍珊珊，等.肉桂-山蒼子復合植物精油對發霉花生黑曲霉BQM菌的抑菌效果[J].中國食品學報， 2021，21（12）：222-229.

[27] 陳可欣，駱鄭航，李玲，等.香樟精油抑制灰綠曲霉的活性與機理研究[J].中國糧油學報，2021，36（3）：71-78.

[28] HU Z Y， YUAN K， ZHOU Q， et al. Mechanism of antifungal activity of Perilla frutescens essential oil against Aspergillus flavus by transcriptomic analysis[J]. Food Control，2021，123：10773.

[29] 劉歡，夏光輝，溫春野.復配精油對采后葡萄灰霉菌抑制作用的研究[J].食品工業科技，2014，35（21）：115-118+122.

[30] 蔣夢曦，林福興，別小妹，等.Iturin A與肉桂精油復配提升櫻桃番茄貯藏品質[J].食品與發酵工業，2019，45（19）：206-212.