Notch信號通路與肝癌相關的研究進展

呂川川，方永平，李坤平

1.廣東醫科大學，廣東 湛江 524023；2.廣東醫科大學惠州第一臨床學院，廣東 惠州 516000

原發性肝癌是一種侵襲性癌癥，其死亡率在惡性腫瘤中居第二位，是全球癌癥相關死亡第三大常見原因，嚴重威脅人類的生命健康和社會發展［1］。肝細胞性肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是原發性肝癌的主要組織學亞型，占原發性肝臟惡性腫瘤總病例的90%以上。中國是肝癌的高發國家之一，全球約一半的新發和死亡病例都發生在中國［2-3］，但目前對肝癌相關信號通路的研究仍未十分明確，因此對肝癌信號通路的研究仍是近期研究熱點，以便為HCC患者找到更有效的治療方式。

Notch 信號通路是一條極其復雜的調控通路，其調控機體內多細胞的分化、增殖和凋亡，對肝臟血管、膽管和免疫細胞的發育也有很大影響［4］。近年來，越來越多的研究表明，Notch 信號通路的異常與肝癌的發生發展存在著密切的聯系，因此，對其進行深入的研究顯得十分重要。在此，本文將從Notch 信號通路的組成，Notch 信號通路激活以及Notch信號通路在肝癌中的作用做一綜述。

1 Notch信號通路

1911年，Morgan 和他的同事首次描述了由于X 染色體上一個基因的雜合子缺失而導致果蠅翅膀邊緣有一個缺口，這個缺口后來被命名為“Notch”。1985 年，Wharton和他的同事對Notch 的結構和功能進行了初步描述，發現它是一種細胞內通路，參與多種細胞過程，其異常導致了大量的人類疾病，從遺傳性疾病到各種惡性腫瘤（乳腺癌、肺腺癌、肝細胞癌、卵巢癌、結直腸癌以及多種血液惡性腫瘤）都發現Notch 信號通路的調節異常［5］。Notch 信號通路是一條進化上高度保守的信號通路，其通過鄰近細胞的相互作用，從一個細胞上的跨膜配體激活另一個細胞上的跨膜受體，而且其也是許多重要信號通路的交點。近年來，Notch 信號通路成為肝癌研究的重點和難點，該條信號通路有望成為肝癌治療的新靶點。

2 Notch信號通路的組成

Notch 信 號 通 路 由Notch 受 體、Notch 配 體（DSL 蛋白）、細胞內效應器分子（CSL蛋白）組成。

（1）受體：Notch 受體是單通道I型跨膜蛋白。哺乳動物有4 個Notch 受體（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4），果蠅有1 個Notch 受體（dNotch），線蟲有2 個Notch 受體（LIN-12， GLP-1）。Notch1 和Notch2 在哺乳動物的許多組織中廣泛表達，Notch3 在血管平滑肌和腦周細胞中含量最高［6］，而Notch4 在內皮細胞中含量最高。Notch 受體是后生動物短距離細胞信號系統的一部分，包括一個大的胞外區域（NEC）和一個短的胞內區域（NTM），NTM 分為跨膜區（TM）和胞內區（ICN），NTM 在Notch信號通路中發揮著與下游效應蛋白的核定位和蛋白穩定性等作用。NEC 是與配體結合的區域，包含一組相鄰的表皮生長因子（EGF）結構域和膜近端負調控區（NRR）。在EGF 結構域重復區中包括結合Ca2+的EGF 結構域和非結合Ca2+的EGF結構域。在EGF 結構域之后是3 個富含半胱氨酸的Lin-12-Notch（LNR）重復序列和兩個介導異二聚化（HD）的疏水區域（HD-N、HD-C） 以及位點1（S1） 和位點2（S2） 切割位點，一起形成與細胞膜相鄰的負調控區（NRR）。該區域通過隱藏和保護S2切割位點免受金屬蛋白酶的影響，防止Notch 受體的配體非依賴性激活，即在沒有配體的情況下，NRR 發揮著阻止受體激活。NRR 在Notch1 和Notch2 中 也 不 同，HD-N、HD-C 和LNR-C 在Notch1NRR 中包含氫鍵，而在Notch2NRR 中存在Zn2+配位位點。S1 位點位于HD 亞結構域突出的非結構化環內。位點3（S3）切割位點位于跨膜片段內，并被γ-分泌酶復合物切割以釋放Notch 胞內結構域（NICD）。NICD 是一種轉錄共激活因子，包含一個J-kappa（RBP-J）-結合分子（RAM）結構域的重組信號結合蛋白、7個錨蛋白重復序列（ANK）、核定位信號（NLS）、一個轉錄激活結構域（TAD）以及富含脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸殘基（PEST） 序列的區域。RAM 結構域和ANK 重復序列均已被確定為與CSL 轉錄因子相互作用的區域。TAD 區域存在于Notch1 和Notch2 中，但哺乳動物的Notch3 和Notch4中不存在。C 末端PEST 結構域通過蛋白水解參與NICD 降解［7］。EGF 結構域的數量因物種而異，Notch 受體的數量也因物種而異，但其分子結構是相似的。哺乳動物中Notch 蛋白的胞外結構域包含29～36 個串聯EGF 樣重復序列，Notch1 和Notch2 含有36 個EGF，Notch3 和Notch4 分別含有34 和29 個EGF。Notch（1～4）受體的差別主要集中EGF上，這些差別是受體與配體有效結合所必需的。這些EGF 重復序列包含添加N 連接聚糖和O 連接聚糖的位點。研究表明，Notch1 和Notch2 只有53%的氨基酸相似性，區分Notch1 和Notch2 的差異可能取決于Notch 激活的整體強度［8］。（2）配體：Notch 配體也是單通道I 型跨膜蛋白。哺乳動物的基因組有2 類同源基因的5 種Notch 配體， 即3 個Delta 樣 配 體： Delta-like1、 Delta-like3、Delta-like4 （DLL1、DLL 3、DLL4），和2 個Serrate 樣配體：Jagged1、Jagged2（JAG1、JAG2），它們統稱為DSL蛋白。果蠅中有2 個典型的配體：Delta 和Serrate。線蟲有4 種 配體：LAG-2、APX-1、ARG-1 和DSL-1。Delta樣配體是由EGF 重復序列、Delta SerrateLAG2（DSL）域和氨基末端（NT）域3 部分組成。Serrate 樣配體是由富含半胱氨酸的結構域（CRD）、EGF 重復序列、DSL 域和NT 域四部分組成。DSL 配體的EGF 重復序列由6-16 不等。DSL 和NT 是Notch 受體-配體相互作用的位點。NT結構域具有磷脂結合的特性，參與鄰近細胞膜的相互作用［9］。有趣的是，在5 種配體中，DLL3 表現出與其他配體明顯的差異，DLL3 定位在高爾基體中，在過度表達時出現在細胞表面。DLL3 不與Notch 受體結合，但在順式中使Notch 信號失活。DLL3 還通過細胞內滯留阻止Notch和/或DLL1 在細胞表面的定位。因此，DLL3 被認為是Notch 信號傳導的細胞自主抑制劑。它也是ASCL1 的直接下游靶標，ASCL1 是一種與肺神經內分泌細胞發育相關額轉錄因子。這些發現表明DLL3 與神經內分泌腫瘤發生有關，尤其是在肺癌中［10］。（3）細胞內效應分子：CSL通常指的是同源蛋白家族有3 個同源物：哺乳動物中為CBF-1，又稱為RBP-JK（重組結合蛋白Jk），果蠅中為Su（H）（無毛抑制蛋白），線蟲中為Lag1。CSL 蛋白由3 個結構域組成，分別為N 端結構域（NTD）、β-三葉型結構域（BTD）和C 端結構域（CTD）。它們由一條長β 鏈連接，將各個結構域整合成一個獨特的奇異折疊。CSL 中的NTD參與DNA 結合，CTD 參與蛋白質-蛋白質相互作用，而BTD 與NTD、CTD 一起參與DNA 結合和蛋白質-蛋白質相互作用。BTD與其他含β-三葉結構域的蛋白質相比，其包含白細胞介素-1 和成纖維細胞生長因子家族。典型的β-三葉形褶皺是一個β-桶狀結構，由12 個β-鏈組成，其中4 個β-鏈組以假三重對稱排列方式排列，3 個β-發夾形成帽狀結構。然而，在Notch 信號傳導中BTD 還發揮著另一個重要作用，遠離DNA 的BTD 的表面上不存在來自帽的兩條β鏈，留下一個暴露在表面的疏水袋，這是用于結合其他蛋白質的位點［11］。CSL 在Notch 信號通路中發揮著關鍵作用，Notch 細胞內結構域（NICD）異位到細胞核后，CSL 形成多個復合物，其中一些復合物可以通過NICD 被Notch信號激活，而另一些復合物則對NICD不敏感［12］。

3 Notch信號通路的激活

Notch 信號通路的激活是通過Notch 受體與鄰近細胞中的配體相互作用來實現的，這種相互作用需要經過3 次酶切割過程完成。首先，Notch 受體前體蛋白在內質網合成，新合成的Notch 蛋白被糖基化，然后在高爾基體內被furin蛋白酶轉化酶（弗林蛋白酶）在S1 位點進行第一次切割，形成NEC 和NTM，它們通過HD 的N-端和C-端之間的非共價相互作用結合在一起。S1 切割可能發生在NRR 分泌途徑中。在到達信號接收細胞表面后NECD 與來自信號發送細胞的配體結合，配體內吞進入信號發送細胞，然后對Notch 施加壓力，導致Notch 異二聚體解離以及ADAM17 蛋白（也稱腫瘤壞死因子-α 轉化酶，TACE）對Notch 在S2 進行第二次切割，N 端裂解片段被配體細胞所吞噬，C 端裂解片段被γ-分泌酶復合物（包含早老素蛋白1/2，呆蛋白，PEN-2蛋白和Aph-1蛋白）在S3/S4位點進行第三次切割，切割的NICD 從膜上釋放出來，然后異位到細胞核，結合KappaJ 區的信號免疫球蛋白（signal binding proteinforimmunoglobulin kappaJ region，RBPJ）、操縱子樣蛋白家族（Mastermind-like family membrs，MAML1）以及其他激活物共同形成Notch 轉錄激活物復合物以誘導Notch 靶基因的表達［13-14］。

4 Notch信號通路在肝癌中的研究

Notch 信號在正常肝臟發育和肝臟腫瘤形成中都發揮著重要作用。目前，Notch 信號在肝癌中的作用存在爭議，一些研究認為，Notch 信號在HCC 中起到腫瘤抑制因子的作用［15］。然而，更多的證據支持Notch 在肝癌發展中的致 癌 作 用。 Liu 等［16］發 現 Synaptojanin 2 結 合 蛋 白（SYNJ2BP）通過激活DLL4 介導的Notch 信號通路來抑制HCC 的生長和轉移。Han 等［17］發現首次表明miR-449a 是反映HCC 惡性程度的短期復發相關miRNA，可以直接通過與其mRNA 的3′UTR 結合來靶向Notch1 使Notch 信號通路失活，并通過調節上皮間質轉化（EMT）在體外和體內抑制HCC細胞的侵襲和遷移。Sarah等［18］研究發現在HCC中Notch有效誘導靶基因HES5表達，并且表現出促腫瘤和抗腫瘤作用。在MYC 誘導的HCC 中，HES5 抑制HCC 生長，而在AKT 誘導的HCC 中，則促進腫瘤形成。在Nakano等［19］研究中，證明了Notch的兩種配體Dll4和Jag1在調節HCC 進展中表現出相互拮抗作用。實驗中使用二乙基亞硝胺（DEN）誘導的肝癌發生模型表明，Dll4 的缺乏使Notch1 信號通路失活并抑制HCC 的進展。相比之下，敲除Jag1 導致Dll4 在其他不表達的肝細胞中異位表達，同時丟失Notch2 信號，促進HCC 的進展。這些結果表明，兩組不同的Notch 配體和受體對HCC 的進展會產生相反的影響。

腫瘤微環境（TME）在調節肝纖維化、肝癌發生、上皮間質轉化（EMT）、腫瘤侵襲和腫瘤轉移中發揮著不可或缺的作用［20］。Tspan5 通過增加由γ-分泌酶催化的Notch S3 位點的切割來激活Notch 信號，增強Notch 依賴性EMT 來促進HCC 的細胞遷移和腫瘤轉移［21］。在HCC 腫瘤微環境中發現的細胞類型主要包括肝星狀細胞（HSC）、癌癥干細胞（CSC）、免疫細胞、內皮細胞、腫瘤相關巨噬細胞（TAM）和癌癥相關成纖維細胞（CAF）等［22］。CSC 參與HCC 的生長和轉移，HIF 1-α 通過激活Notch1 誘導EMT 促進HCC 的CSC 特征［23］。TAM 通過釋放促腫瘤細胞因子促進腫瘤的發展，在HCC 進展和轉移中起關鍵作用。在Hepa1-6 HCC 模型中骨髓特異性Notch 缺乏不僅可以通過增加局部Kupffer 細胞樣TAM（kclTAM）增殖來補充單核細胞TAM 的減少，而且還可能引起kclTAMs的更強的促癌活性，參與加速HCC生長，但這一結論還需要其他HCC 細胞系來證實［24］。CAF 在癌細胞與腫瘤微環境之間起著至關重要作用，CAF分泌的IL-6通過STAT3磷酸化激活Notch信號通路，從而促進HCC進展。

異常的Notch 信號傳導是HCC 腫瘤發生、發展的重要因素。有研究首次證實表皮生長因子樣結構域（EGFL）基因家族成員參與HCC。此外，他們進一步發現EGFL8的下調與HCC 的進展和預后不良相關，并通過激活Notch 信號通路調節HCC 細胞遷移、侵襲和凋亡，但EGFL8 對肝癌細胞凋亡的促進作用較弱，表明EGFL8 可能是HCC 一種新的治療靶點和潛在的預后標志物。一項研究［25］發現GPR50 在HCC 中過表達，并且GPR50 敲低可以通過下調Notch信號通路來抑制HCC進展。他們的研究結果還表明，GPR50 與去整合素和金屬肽酶結構域17（ADAM17）形成一種新型分子復合物，調節ADAM17活性，以不依賴配體的方式激活HCC 中的Notch 信號通路。哺乳動物的直系同源物（ENAH）是一種肌動蛋白結合蛋白。從功能上講，ENAH 有助于HCC 的細胞增殖、侵襲和遷移。從機制上講，剪接因子3b亞基4（SF3B4）作為ENAH 的RNA 結合蛋白并在HCC 中正向調節ENAH。此外，SF3B4 調控的ENAH 通過激活Notch信號促進HCC的發展。環指蛋白187（RNF187）是一種含有RING 結構域的泛素E3 連接酶，是Notch1促進HCC侵襲和轉移的重要因子，它通過誘導HCC細胞的上皮間質轉化促進HCC 轉移。Chen 等［26］研究表明長鏈非編碼RNA（lncRNA）RUSC1-AS1 通過Notch3 軸激活Notch 信號通路，促進HCC 細胞增殖，抑制HCC 細胞凋亡，從而發揮致癌的作用。

綜上所述，Notch 信號通路在肝癌中的作用是作為腫瘤抑制因子還是腫瘤促進因子已初步達成共識，但其在肝癌當中具體的分子機制仍需深入探究。隨著科學技術的進步和發展，我們定會明確Notch 信號通路在肝癌中的具體分子機制，這將為肝癌靶向治療提供新的靶點，為肝癌的預防提供新的方向。