基于腸-免疫-皮膚軸研究犀角地黃湯對銀屑病小鼠腸道Th17/Treg失衡的影響*

黃港，袁弦，胡初向，付佳俊，史海勇，辛俏，楊蜜，龔麗萍

1 江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西南昌 330004

2 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 江西南昌 330006

銀屑病是一種由自身免疫介導(dǎo)、多種因素影響的慢性炎癥性皮膚病，其發(fā)病機制尚不明確。近年來，腸道菌群與銀屑病發(fā)病機制的相關(guān)性已成為研究的熱點[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的失衡可以誘發(fā)銀屑病的產(chǎn)生，導(dǎo)致其皮膚病變的機理與Th17/Treg細(xì)胞的平衡以及T細(xì)胞分化和功能的調(diào)節(jié)有關(guān)[2]。現(xiàn)代實驗表明，銀屑病的發(fā)生與不可或缺的炎性因子如IL-23、IL-17及TNF-α等密切相關(guān)，而這些因子是由Th17細(xì)胞產(chǎn)生的。因此抑制其信號通路的生物制劑對治療銀屑病有良好的療效[3-4]。蘇陽等[5]研究發(fā)現(xiàn)洋金花醉茄內(nèi)酯類化合物治療銀屑病有效是通過調(diào)節(jié)腸道Th17/Treg軸的信號通路。中醫(yī)認(rèn)為，銀屑病血熱證一般為進(jìn)展期，其可以破壞Th17與Treg細(xì)胞之間的平衡，Th17會抑制Treg細(xì)胞的功能[6]，而犀角地黃湯為涼血活血之劑，正好符合銀屑病血熱證的病機，可有效的治療銀屑病。本實驗將腸、皮膚、免疫視為一個整體，從此角度探討犀角地黃湯對銀屑病小鼠腸道Th17/Treg失衡的影響及其機制。

材料與方法

1 動物

由江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供動物BALB/c雄性小鼠，體質(zhì)量20～22g，周齡6～8周，動物許可證編號SCXK（贛）2018-002，飼養(yǎng)于SPF級動物室。

2 藥物、試劑、儀器

戊巴比妥鈉、5%咪喹莫特乳膏42mg（四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號110206），培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、雙歧桿茵B(yǎng)S培養(yǎng)基等）（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）、犀角地黃湯湯劑（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院）、蘇木精-伊紅（HE）染色、采用ELISA法。

3 分組、造模、給藥

將30只BALB/c 小鼠隨機分為模型組、犀角地黃湯低濃度組、犀角地黃湯中濃度組、犀角地黃湯高濃度組、空白對照組，每組均為6只。造模方法：除空白對照組外，其余4組先以戊巴比妥鈉（80mg/kg）經(jīng)腹腔注射麻醉，后背部進(jìn)行脫毛處理，面積為2cm×3cm大小的暴露區(qū)域，于第二天脫毛區(qū)域涂抹5%咪喹莫特乳膏42mg（四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號110206），1次/d，連續(xù)7d。造模成功后，空白對照組、模型組每天給予等量的蒸餾水（0.1mL/10g）；犀角地黃湯低、中、高濃度分別對應(yīng)中藥治療的低、中、高三組，濃度為80mg/mL、160mg/mL、320mg/mL，每只小鼠灌胃與空白對照組劑量相同。1次/d，連續(xù)2周。

4 檢測指標(biāo)及方法

4.1 小鼠銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度評估 根據(jù)小鼠皮損的紅斑、 鱗屑及浸潤等程度評分，分值為0～4分；再將三者積分相加得到總積分。隨后每組小鼠積分取平均值。PASI 評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0：無；1：輕度；2：中度；3：重度；4：極重度。

4.2 銀屑病小鼠腸系膜淋巴結(jié)相關(guān)細(xì)胞因子含量的測定 采用ELISA法測定銀屑病小鼠腸系膜淋巴結(jié)中IL-17、IL-23及TNF-α等細(xì)胞因子的含量。

4.3 銀屑病小鼠糞便細(xì)菌培養(yǎng)計數(shù) 在超凈工作臺內(nèi)提取大鼠糞便，后稀釋及接種培養(yǎng)，均30min內(nèi)完成。將雙歧桿菌、乳酸桿茵培養(yǎng)基置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72h；將腸球菌、腸桿菌培養(yǎng)基置于普通37℃恒溫培養(yǎng)箱中，24～48h觀察結(jié)果。計算公式為培養(yǎng)皿表面的菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/滴種體積（mL），結(jié)果菌落形成單位的Log值表示，即為CFU/g。

5 統(tǒng)計學(xué)方法

對于數(shù)據(jù)分析使用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)以±s表示。若總體符合正態(tài)分布且方差相同時采用單因素方差分析，否則用秩和檢驗。運用分層分析和Logistic回歸分析細(xì)胞因子相關(guān)性。

結(jié) 果

1 小鼠皮損PASI評分結(jié)果

銀屑病小鼠背部皮膚可見紅斑、鱗屑等皮損，有浸潤感，第7天最為嚴(yán)重。PASI評分顯示，除空白組外，與模型組比較，中藥各濃度組評分均有所降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組小鼠PASI評分比較（ ±s）

表1 各組小鼠PASI評分比較（ ±s）

注：與空白組比較，P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別例數(shù)PASI評分空白組60模型組68.63±0.3*低濃度組67.73±0.25*中濃度組66.42±0.2*高濃度組64.28±0.26*

2 小鼠腸系膜淋巴結(jié)相關(guān)細(xì)胞因子含量變化

與空白組相比，模型組小鼠的血清炎癥因子IL-17、IL-23和TNF-α皆升高。與模型組相比，中藥各濃度組細(xì)胞因子含量降低（P＜0.05），且濃度組之間P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 小鼠糞便細(xì)菌培養(yǎng)計數(shù)培養(yǎng)變化

相對于空白組，模型組小鼠乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)目減少，腸球菌及腸桿菌數(shù)增多；與模型組相比，中藥各劑量組乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)明顯增多，腸球菌、腸桿菌數(shù)減少（P＜0.05）。

討 論

銀屑病是一種自身免疫性疾病，發(fā)病機制與T細(xì)胞密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)CD4+ T 細(xì)胞可以分化T 輔助細(xì)胞（Th17）和 Treg 細(xì)胞。Th17細(xì)胞受到刺激會產(chǎn)生IL-23、IL-17等細(xì)胞炎癥因子，且這些炎癥因子可促進(jìn)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖和異常分化，從而發(fā)生炎癥，此為銀屑病發(fā)病機制的核心；另一種亞群Treg細(xì)胞的主要作用是抑制免疫；而兩者之間處于相對平衡狀態(tài)，這種平衡對于自身免疫反應(yīng)發(fā)病機制至關(guān)重要，一旦失衡將引起免疫性疾病[7-9]。有研究表明，銀屑病患者中Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞表達(dá)值均升高，其比值也升高[10]。因此，Th17/Treg細(xì)胞的平衡對銀屑病的發(fā)病機制至關(guān)重要。

現(xiàn)代研究表明，腸道免疫系統(tǒng)已成為機體最大的免疫器官，維持著免疫平衡；而腸道菌群中的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸可以間接影響腸道免疫系統(tǒng)的平衡，且限制 Th17 細(xì)胞并促進(jìn) Treg 細(xì)胞分化；一旦菌群失調(diào)則激活自身免疫反應(yīng)，從而引起全身炎癥的發(fā)生[11-12]。有研究表明，腸道菌群參與了在銀屑病的免疫與炎癥反應(yīng)，因此銀屑病患者與健康患者的腸道菌群有所差異，其種類不變，豐度改變；且隨著病情加重，菌群結(jié)構(gòu)紊亂程度也隨之加重[13]。此實驗從西醫(yī)角度我們將腸道、皮膚、免疫系統(tǒng)看成一個整體，而中醫(yī)同樣注重整體觀念，認(rèn)為治療銀屑病可從臟腑盛衰論治。中醫(yī)認(rèn)為“肺主皮毛”，“肺與大腸相表里”，肺的氣機升降會影響大腸的傳導(dǎo)，同時也會影響皮膚的生理功能，三者相互影響，此與西醫(yī)提出的腸-免疫-皮膚軸有相似之處。該實驗結(jié)果也間接表明了皮膚、腸道菌群、免疫反應(yīng)之間相互影響、相互作用。

表2 小鼠中各細(xì)胞因子含量濃度（ ±s）

表2 小鼠中各細(xì)胞因子含量濃度（ ±s）

注：與空白組相比，P＜0.05；與模型組比較，P＜0.05。

組別例數(shù)IL-17/pg/mLIL-23pg/mLTNF-αpg/mL空白組692.93±13.54127.98±18.92115.51±16.01模型組6229.72±21.22a328.39±9.77a 232.93±15.27a低濃度組6212.98±5.93a251.52±9.57b196.75±5.6b中濃度組6178.61±17.53b229.48±15.86c 182.04±13.13b高濃度組6144.69±13.69c198.67±16.95d134.86±9.69c

表3 犀角地黃湯對小鼠糞便腸道菌群的影響（ ±s）

表3 犀角地黃湯對小鼠糞便腸道菌群的影響（ ±s）

注： 與空白組比較，P＜0.05；與模型組比較，P＜0.05。

組別雙歧桿菌/LgN（CFU/g）乳酸桿菌/LgN（CFU/g）腸桿菌/LgN（CFU/g）腸球菌/LgN（CFU/g）空白組8.52±0.598.65±0.486.42±0.886.53±0.52模型組6.68±0.42b5.75±0.32d7.71±0.6a7.65±0.51a低濃度組8.23±0.79a7.34±0.47c7.32±0.75ab6.9±0.44b中濃度組8.41±0.18a8.00±0.13b6.69±0.38bc6.45±0.28b高濃度組8.74±0.42a8.62±0.26a6.68±0.31bc5.86±0.44c

多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為，銀屑病多從“血”論治，血熱證為伊始，而血熱證的形成與多種因素相關(guān)，外因不外乎外感六淫、喜食肥甘厚味之品等，內(nèi)因為七情內(nèi)傷或稟賦不足等，兩者相合致氣機不暢、郁久化熱而為病。趙炳南等認(rèn)為血熱證貫穿發(fā)病的始終[14-15]。此治法應(yīng)以清熱涼血為主。犀角地黃湯為熱入血分的代表方，由犀角、生地黃、赤芍、牡丹皮組成，方中以犀角為君，清熱涼血解毒。現(xiàn)以犀角性味、功效相似的水牛角代替。地黃滋陰養(yǎng)血，牡丹皮、赤芍清熱涼血。四藥相配，共奏清熱涼血、活血養(yǎng)陰之功，使涼血而不凝滯，清熱而不傷陰[16]。正好契合銀屑病血熱證病機。現(xiàn)代藥理學(xué)表明，地黃、牡丹皮中提取成分對大腸桿菌等有抑制作用，且可以提高機體的免疫力；赤芍可通過調(diào)控炎癥因子降低炎癥反應(yīng)[17-19]。

本實驗通過觀察由咪喹莫特乳膏誘導(dǎo)的小鼠PASI評分、細(xì)胞炎癥因子含量、腸道細(xì)菌培養(yǎng)計數(shù)等觀察指標(biāo)，結(jié)果表明：①與模型組相比，犀角地黃湯各濃度組可以降低PASI評分，改善小鼠紅斑、鱗屑等癥狀，且高濃度組改變最為明顯；②模型組中IL-17、IL-23、TNF-α等細(xì)胞因子含量高于空白組、犀角地黃湯各濃度組（P＜0.05）；③犀角地黃各劑量組乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)明顯少于模型組（P＜0.05），腸球菌、腸桿菌數(shù)明顯多于模型組（P＜0.05）。實驗提示了犀角地黃湯治療銀屑病有效，此機制可能是通過下調(diào)銀屑病小鼠中IL-17、IL-23、TNF-α等細(xì)胞因子的含量以達(dá)到緩解小鼠炎癥的作用，進(jìn)而改善Th17/Treg 細(xì)胞失衡狀態(tài)。以上結(jié)果進(jìn)一步證實了銀屑病小鼠模型的免疫炎癥反應(yīng)與Th17/Treg 細(xì)胞平衡有關(guān)。本實驗還進(jìn)一步探討了犀角地黃湯給藥對于銀屑病小鼠腸道菌群的影響。有研究表明，腸道中致病菌如腸球菌等產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物可以誘導(dǎo)引起免疫炎癥反應(yīng)，而益生菌如乳酸桿菌、雙歧桿菌等可以調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境，提高機體免疫反應(yīng)[20]。而此實驗結(jié)果與之一致，提示犀角地黃湯可以提高乳酸桿菌、雙歧桿菌豐度，降低腸球菌及腸桿菌數(shù)，達(dá)到改善腸道菌群結(jié)構(gòu)的效果，調(diào)整Th17/Treg 細(xì)胞失衡，從而改善免疫炎癥反應(yīng)。

由此可知，犀角地黃湯可以緩解銀屑病癥狀，降低炎癥因子的含量，此機制可能與調(diào)節(jié)腸道菌群與Th17/Treg細(xì)胞的平衡有關(guān)。但中藥成分多、靶點復(fù)雜，中藥之間又相互作用，同時中藥濃度也有影響，因此其改善小鼠皮損癥狀的具體機制需進(jìn)一步探討研究。