淫羊藿苷對(duì)錳致小鼠精母細(xì)胞死亡的抑制作用*

賀佳琪，田春花，胡元梅，蔡仁蓮，檀軍，陸祥，田瑩

1 遵義醫(yī)科大學(xué)，組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 貴州遵義 563000

2 遵義醫(yī)科大學(xué)，形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室 貴州遵義 563000

錳，廣泛存在于自然界中，常見于以化合物的形式存在，在地殼內(nèi)其平均含量為0.1%，是已知元素的第十五位[1]。其在機(jī)體正常發(fā)育、脂類、氨基酸和葡萄糖代謝及細(xì)胞能量調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[2]。錳是國(guó)民經(jīng)濟(jì)中重要的基礎(chǔ)物資和國(guó)家重要戰(zhàn)略資源之一，我國(guó)是全球最大的錳生產(chǎn)國(guó)、消費(fèi)國(guó)和出口國(guó)，錳礦在西南地區(qū)主要分布于重慶和貴州等地[3]。但近年來(lái)，隨著無(wú)鉛汽油、農(nóng)藥代森錳等的廣泛使用，以及錳礦的開采、錳合金的冶煉、電焊時(shí)的大量煙塵，造成環(huán)境中錳的含量逐漸升高，增加了普通人群接觸錳的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致錳在體內(nèi)的濃度失衡[4]，誘發(fā)誘發(fā)嚴(yán)重不可逆的精神和錐體外系運(yùn)動(dòng)功能障礙，出現(xiàn)帕金森綜合征的臨床表現(xiàn)，過(guò)量錳進(jìn)入人體也會(huì)影響生殖功能[5]。研究顯示，錳可使男工的生殖能力減弱，其妻子自然流產(chǎn)率和死胎率可隨著其丈夫接觸錳時(shí)間的增加而升高[6]。國(guó)發(fā)[2022]2號(hào)文件指出“實(shí)施磷、錳、赤泥、煤矸石污染專項(xiàng)治理……”可見國(guó)家對(duì)錳污染危害的重視。

淫羊藿（Epimedium brevicornu Maxim，EbM），別名仙靈脾，是臨床常用的傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥。據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》（2020版）記載，EbM主要功能有溫補(bǔ)肝腎、強(qiáng)健筋骨、祛風(fēng)濕等[7]。研究表明，EbM主要含有黃酮類、多糖類、揮發(fā)油、生物堿及鉀、鈣、鎂等多種微量元素，具有清除自由基、抗氧化、抑制DNA損傷、調(diào)節(jié)雄性生殖功能的作用，其主要活性成分為淫羊藿苷（Icariin，ICA）[8]。研究報(bào)道，ICA可通過(guò)抵抗氧化損傷、抑制生精細(xì)胞凋亡來(lái)改善由尼古丁、酒精所致的睪丸損傷，但是，ICA能否抑制錳誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞損傷？本文在前期對(duì)錳影響生殖功能研究的基礎(chǔ)上，對(duì)小鼠精母細(xì)胞GC-2spd（ts）進(jìn)行一定劑量的錳染毒，探討ICA對(duì)錳致生殖損傷是否具有修復(fù)作用，為錳致不育癥及生殖損傷的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

儀器與材料

1 實(shí)驗(yàn)儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)，型號(hào)：Forma3121）；生物安全柜（Midea，中國(guó)，型號(hào)HR60-ⅡA2）；酶標(biāo)儀（SpectraMax M2，MolecuLar Devices，美國(guó)）；倒置相差顯微鏡（Olympus Corporation，日本，型號(hào)：CKX53）。

2 材料

GC-2spd（ts）細(xì)胞株購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)；ICA（純度98.61%，批號(hào)：160920）購(gòu)自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；MTT（貨號(hào)：ST316）、二甲基亞砜溶液（DMSO，貨號(hào)：ST038）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM（貨號(hào)：8121045）、胰酶均為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為杭州四季青產(chǎn)品；甲醇（分析純）。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 藥物配制 稱取3.38 mg ICA粉末溶于100 μL甲醇中，在37℃水浴箱中加熱5 min后，在搖床上震蕩，待ICA完全溶解，即配制500 μmol/L ICA（母液），取母液稀釋使用，ICA在細(xì)胞培養(yǎng)液中終濃度為0.05、0.5、5、50 μmoL/L。

3.2 細(xì)胞染毒 GC-2spd（ts）采用DMEM高糖培養(yǎng)基（含1% Glutamax，100 mmoL/L Sodium Pyruvate Solution），添加10%胎牛血清，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分為空白對(duì)照組（Control）、陰性對(duì)照組（含等體積溶劑甲醇）、錳染毒模型組（MnCl2）、淫羊藿苷組（ICA）、淫羊藿苷干預(yù)組（ICA+MnCl2）、溶劑與淫羊藿苷組（甲醇+ICA），每一組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。參考前期預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索的MnCl2作用于GC-2spd（ts）細(xì)胞24 h、72 h的IC50加MnCl2（24 h的IC50為5.23×10-3mol/L，72 h的IC50為3.23×10-4mol/L）。3.3 MTT法檢測(cè)GC-2spd（ts）細(xì)胞活力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GC-2spd（ts）細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種至96孔板中，每孔100 μL，接種細(xì)胞數(shù)量為每孔5×103個(gè)，每一組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次[9]，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后，向每孔分別加入10 μL MTT試劑（5 mg/mL），避光培養(yǎng)4 h后[10]，棄上清，每孔分別加入100 μL DMSO，振蕩5 min，再放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)30 min，以 確 保 結(jié) 晶 充 分 溶 解。甲瓚充分溶解后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度（OD）值[11]，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%） =（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值） /（對(duì)照孔OD值-空白組OD值） × 100% 。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.3.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度的ICA對(duì)GC-2spd（ts）細(xì)胞增殖活性的影響

MTT法檢測(cè)用甲醇溶解的不同濃度（0.05、0.5、5、50μmol/L）ICA處理的GC-2spd（ts）細(xì)胞，在作用48 h之后檢測(cè)細(xì)胞存活率。甲醇組的存活率為（99.40±2.24）%，0.05、0.5、5、50 μmol/L ICA干預(yù)組的GC-2spd（ts）存活率為（108.04±4.83）%、（111.86±3.67）%、（106.43±3.67）%、（115.58±2.95）%，上述結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，雖然各濃度ICA干預(yù)組的細(xì)胞存活率都略高于對(duì)照組，但只有50 μmoL/L ICA具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，ICA濃度為5 μmoL/L時(shí)，細(xì)胞存活率略低，ICA濃度為50 μmoL/L的時(shí)候，細(xì)胞存活率相對(duì)較高，表明50 μmoL/L ICA可促進(jìn)小鼠精母細(xì)胞GC-2spd（ts）增殖。

2 ICA作用48 h對(duì)MnCl2誘導(dǎo)GC-2spd（ts）細(xì)胞死亡的抑制作用

MnCl2組與空白對(duì)照組相比細(xì)胞存活率顯著下降（P＜0.05），錳染毒組加入溶劑（甲醇）以及不同濃度ICA（0.05、0.5、5、50 μmol/L）進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)ICA對(duì)于MnCl2損傷的GC-2spd（ts）細(xì)胞有顯著的修復(fù)作用（P＜0.05）。其中，甲醇組的存活率為91.59±3.41%，MnCl2染毒組的存活率為（8.31±0.70）%，0.05、0.5、5、50 μmol/L ICA干預(yù)組的GC-2spd（ts）細(xì)胞存活率分別為（79.48±1.87）%、（81.58±1.51）%、（75.68±1.98）%、（68.87±1.58）%，MnCl2與甲醇共同作用組的存活率為（64.66±2.60）%。上述結(jié)果表明，各濃度ICA干預(yù)組的細(xì)胞存活率都高于MnCl2組，差異顯著（P＜0.05），其中，ICA濃度為0.5 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率最高，ICA濃度為50 μmol/L的時(shí)候，細(xì)胞存活率相對(duì)較低。

圖1 ICA作用48 h對(duì)GC-2spd（ts）細(xì)胞存活率的影響

圖2 ICA作用48 h對(duì)MnCl2誘導(dǎo)GC-2spd（ts）細(xì)胞死亡的抑制作用

討 論

錳在自然界中分布廣泛，隨著我國(guó)錳礦開采，錳中毒所帶來(lái)的問(wèn)題也隨之而來(lái)。研究表明，錳對(duì)性功能有一定的影響，主要體現(xiàn)在性欲減退、排精障礙、早泄、陽(yáng)痿等；錳礦工人的妻子流產(chǎn)率、死胎率在上升。錳可使細(xì)胞產(chǎn)生大量自由基，損傷線粒體，致使ATP合成明顯減少或使上調(diào)促凋亡蛋白表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。但目前尚無(wú)有效的預(yù)防及治療措施。

淫羊藿苷（ICA）對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸功能、性激素生成、性器官及性功能有一定促進(jìn)作用，可以促進(jìn)睪酮合成、促進(jìn)精子生成并改善精子生成的微環(huán)境。ICA對(duì)男性生殖系統(tǒng)損傷具有保護(hù)作用，可改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)大鼠睪丸生精障礙[13]、酒精致雄性小鼠生殖損傷[14]，以及改善 GC-1細(xì)胞DNA氧化損傷[15]，其還可促進(jìn)陰莖勃起，治療早泄等[16]。但I(xiàn)CA對(duì)于錳致的生殖損傷是否有修復(fù)作用，目前尚未見報(bào)道。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)高劑量錳對(duì)于生精母細(xì)胞GC-2spd（ts）有損傷作用，基于此，我們進(jìn)一步探究ICA對(duì)錳致精母細(xì)胞GC-2spd（ts）的損傷是否具有修復(fù)作用。研究結(jié)果表明，錳染后GC-2spd（ts）細(xì)胞皺縮、漂浮，使用ICA進(jìn)行干預(yù)后，GC-2spd（ts）細(xì)胞恢復(fù)正常，且細(xì)胞存活率得到明顯提高。研究表明，九香蟲提取物對(duì)MnCl2致生殖損傷具有一定修復(fù)作用，可能是通過(guò)抑制凋亡相關(guān)基因如Bax、Cyt c以及Caspase 3的表達(dá)從而抑制其凋亡，但I(xiàn)CA對(duì)MnCl2致生殖損傷修復(fù)作用的機(jī)制尚不明確，可進(jìn)行深入的研究，本文所使用的小鼠的精母細(xì)胞GC-2spd（ts）轉(zhuǎn)染了SV40大T抗原基因，其p53抑癌基因（溫度敏感）發(fā)生突變，該細(xì)胞經(jīng)過(guò)G418篩選，已喪失其分化潛能，處于減數(shù)分裂前期，故可利用該細(xì)胞在體外進(jìn)行生殖損傷修復(fù)研究。但其與精母細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的狀態(tài)仍有所不同，后期還需進(jìn)一步利用動(dòng)物模型開展體內(nèi)生殖損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)研究。本文研究發(fā)現(xiàn)，MnCl2與甲醇共同作用組相較于MnCl2組細(xì)胞存活率有顯著升高，推測(cè)其成分可能對(duì)MnCl2的生殖毒理作用有影響，但具體機(jī)制尚不明確，可進(jìn)行深入研究，此外，還可進(jìn)一步選擇DMSO、甲醇、羧甲基纖維素鈉溶解ICA進(jìn)行生殖損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)。以期為錳致生殖損傷的預(yù)防、治療提供參考。