祛腐生肌外治法對糖尿病潰瘍大鼠血管內皮細胞生長因子（VEGF）及其相關信號通路影響的meta分析和系統評價*

蔣立新，朱思洵，2

1 江蘇省江陰市中醫院 江蘇無錫 214400

2 南京中醫藥大學 江蘇南京 210023

糖尿病足潰瘍（Diabetic Foot Ulcer，DFU）是指糖尿病患者在長期高血糖的基礎上出現的不同程度的神經、末梢血管病變，引起的下肢肢體的潰瘍、感染和（或）深層組織的破壞[1]。數據顯示，2019年全球約有4.63億20～79歲成人患糖尿病糖尿病患者，在未來30年里這個數字還將成倍增長。相比于西方國家，我國的糖尿病患者居于世界首位，形勢將更加嚴峻[2]。糖尿病患者中約 15 %會出現足部潰瘍，其中需要截肢的概率為 15%～20%[3-4]。人口老年化的加劇和糖尿病并發癥的高發，更是導致了DFU治療難度加大，病程長、花費高昂，其顯著的影響著糖尿病患者的生活質量及國家的財政負擔，是外科亟須解決的重大問題和難題[5-6]。

目前，除了控制血糖、清創、防治感染等基礎治療外，DFU的西醫治療方面發展出了很多高新技術，包括重組生長因子治療、基因治療、干細胞治療和生物材料等[7-10]。雖已有許多實驗數據肯定了這些方法的治療效果，但其在臨床治療上不僅費用昂貴，而且穩定性、有效性及安全性等方面仍存在很多亟待解決的問題[11]。祖國醫學將糖尿病足潰瘍歸屬于“消渴脫疽”“筋疽”“瘡瘍”等范疇，臨床表現多為下肢末端的疼痛、潰瘍、感染，甚至壞疽等。中藥外用治療DFU歷史悠久，并在不斷的實踐中積累了豐富的經驗，取得了獨特的療效，并形成了豐富的理論。有著療效顯著、毒副作用小，價格低廉、簡便容易操作的特點。在總結前人治療實踐的基礎上，現代眾多名醫名家提出了“祛腐生肌法”外治治療糖尿病足潰瘍，其理論基礎為“腐肉不祛，新肉不生”，并在不斷的實踐創新中取得了良好的療效。所以，發揮祛腐生肌外治法在治療DFU方面的優勢，并不斷挖掘研究其藥理機制及作用原理，已然成為充分發揮中醫藥特色，實現中醫藥現代化的一個重要課題。

研究表明，血管內皮生長因子VEGF（vascular endothelial growth factor，VEGF）介導的血管修復與再生是DFU愈合的重要環節。在糖尿病患者高糖狀態下，缺氧組織的正常生理反應受到抑制，細胞再生能力降低、促愈細胞因子缺乏及血管化不足，加之創面區域存在血流灌注減少、細胞代謝異常等特點，最終導致DFU愈合時間大大延長，出現嚴重后果[12]。VEGF作為目前已知的特異性最高的、作用最強的促血管生長的多功能細胞因子，具有強大的增強微血管通透性的作用，能促使細胞轉移，加快復制，使血管壁內皮細胞內物質排到胞外，加快新生毛細血管生長[13-15]。因此促進VEGF 水平表達在DFU皮膚及肌肉組織修復愈合的過程有決定性的作用。近年來從分子水平來探討中醫藥促愈機制的研究日益深入，多項關于糖尿病足潰瘍的臨床研究證實了祛腐生肌法中藥外用能夠促進患者血清中VEGF水平的表達，從而幫助創面愈合。另外我們發現，大量研究表明VEGF在創面修復的過程中涉及多個信號通路，其機制十分復雜[16-18]。且對DFU患者進行創面組織取樣的操作涉及到倫理規范，研究不便。故本研究旨在通過全面搜集有關VEGF在祛腐生肌法中藥外用對DFU大鼠模型中表達水平的研究，并挖掘其作用背后的信號通路機制，并為未來的研究提供有價值的循證醫學證據。

資料與方法

1 納入標準

1.1 研究類型 公開發表的，具有獨立治療組和對照組的隨機對照試驗（randomized controlled trials，RCTs），語種限為中文和英文，無論是否采用盲法或分配隱藏。

1.2 研究對象 實驗性糖尿病潰瘍大鼠模型，其動物種屬、性別、年齡、造模方法不限。

1.3 干預措施 治療組均采用中藥祛腐生肌法外用，其中包括驗方、組方（如金黃散、三黃生膚油等）及中成藥（如一效膏、生肌玉紅膏散等）。劑型包括膏劑、散劑、油劑、洗劑等。對照組采用常規換藥治療，可聯合抗生素軟膏、生長因子凝膠等制劑外用。對兩組的換藥方法、頻次、療程及方法等不做限制。

1.4 結局指標 主要結局指標為血管內皮細胞生長因子（VEGF），根據實驗中收集樣本為創面組織或血清的不同，定量測量方法為ELISA、Western Blot、Qpcr的不同。分為DU大鼠創面組織VEGF蛋白表達水平、創面組織VEGF mRNA水平及血清VEGF因子水平。次要結局指標為在相關信號通路中影響VEGF表達水平的上下游因子，這些信號通路包括HIF-1/VEGF/VEGFR-2信號通路、PI3K/AKT信號通路、Wnt/β-catenin信號通路。納入文獻要求結局指標要求必須包含主要結局指標，可不包含次要結局指標。

2 排除標準

①非隨機對照動物試驗，包括個案報道、觀察性研究、綜述等；②中藥內服、中藥灌胃以及中藥提取物外用治療的研究等；③藏藥、苗藥或合并中藥的研究；④實驗動物為犬類、家兔、小鼠等非大鼠的研究；⑤重復發表的，保留一篇數據完整的；⑥結局指標模糊，無法進行數據合并的。

3 檢索策略

檢索建庫至2022年4月公開發表的關于中藥外用治療糖尿病潰瘍大鼠的RCT中英文文獻。檢索的中文數據庫包括中國知網數據庫（CNKI）、萬方數據庫（wanfang data）及中國生物醫學文獻數據庫（CBM），檢索關鍵詞主要為為“糖尿病足/糖尿病潰瘍/代謝性潰瘍；外治法/中藥外用/祛腐生肌；膏劑/散劑/洗劑/油劑；血管內皮細胞生長因子；大鼠”。檢索英文數據庫PubMed、Cochrane library及EMbase，檢索關鍵詞主要為“Diabetic foot/ diabetic ulcer/ metabolic ulcer；External therapies/ external application of traditional Chinese medicine/ Qufushengji；Ointment/Powder/lotion/oil； vascular endothelial growth factor/ VEGF；Rats等”。采用“主題詞”和“自由詞”相結合的檢索策略，會議論文、學位論文及灰色文獻亦在檢索范圍內。

4 資料提取

由2名科研人員獨立進行資料提取，根據預先制定的標準，進行文獻篩選、資料提取及文獻質量評價。若有分歧，則通過第3名研究者參與共同研究解決。資料提取表以Excel文件保存，提取內容主要包括納入文獻的作者、出版年份、動物種類、體質量、樣本量、造模方法、干預措施、療程、結局指標以及設計偏倚風險評價的具體信息。對于文章中有多個對照組時，選取指標改善最明顯的一組；當治療組中藥外用有多個研究劑量時，同樣選取療效最優組。對于論文中結局指標比較只給出柱狀圖、折線圖等，未給出表格及具體數值時，采用GetData 2.20軟件由2名科研人員分別進行數值提取，最后取2人截取的平均值作為結局指標進行統計。

5 文獻質量評價

資料提取 1.4.1 質量評價使用實驗室動物實驗系統評價中心（SYRCLE）偏倚風險評估工具。SYRCLE由Cochrane發展而來，包含10相條目，其中涉及選擇性偏倚，實施偏移，測量偏倚，損耗偏倚，報告偏倚和其他偏倚 6 種偏倚[19]。通過對工具的每個域評分“是”，表明存在偏見的風險較低；“否”，表明存在很 大的偏見風險；如果報告的詳細信息不足，則可以對內部評價和外部有效性進行評分“不確定”。

6 統計學方法

采用Excel統計納入文獻的相應數據，并采用Review Manager 5.4.1進行Meta分析。所有結果均視為連續型數據，采用標準化均數差（standardized mean difference，SMD）評估效應量大小，結局指標的合成結果均以效應值及其95%可信區間（Confidence interval，CI）表示，P＜0.05被認為具有統計學意義。對有各項研究進行異質性分析，若不存在異質性（I2＜50%），采用固定效應模型；若存在異質性（I2＞50%），采用隨機效應模型。但是結局中相關蛋白及分子指標的測定與試劑盒的廠家和型號、研究的年份遠近、研究人員的操作方法和主觀判斷等因素相關，必然存在一定的臨床異質性，故對于異質性較大的研究組，我們仍然對其進行Meta合成，并采用采用隨機效應模型進行分析。對數量≥10的研究進行亞組分析，并繪制漏斗圖判斷是否存在發表偏倚。另外對不良反應進行描述性統計分析。對數量≥10的研究進行亞組分析，并繪制漏斗圖判斷是否存在發表偏倚。

結 果

1 文獻篩選流程及結果

通過對數據庫檢索得到相關文獻119篇，剔除重復文獻后為58篇，通過閱讀標題、摘要和全文，并基于納入標準和排除標準篩選后，最終納入分析的文獻有19篇，均為中文期刊文獻。篩選流程見圖1。

圖1 文獻篩選流程圖

2 納入研究的基本特征

共納入19個研究，文獻發表時間為2010年10月至2022年4月，納入508例實驗大鼠模型，其中試驗組254例，對照組254例，最大樣本量為30，最小為5，最短療程10d，最大療程21d。大鼠品種為 Sprague-Dawley（SD）大鼠和 Wistar 大鼠。14個研究采用SD大鼠，5個研究采用Wistar大鼠，15個研究僅采用雄性，4個研究雌雄不限或未提及性別。18個研究采用腹腔注射STZ進行糖尿病建模，1個研究采用腹腔注射ALX進行糖尿病建模。12個研究采用全程皮膚缺損法進行潰瘍造模，1個研究采用壓力損傷法進行潰瘍造模，5個研究采用蒸汽或恒溫燙傷法進行潰瘍造模，1個研究采用缺血外傷法進行潰瘍造模。納入研究的基本特征見表1。

表1 納入文獻的基本特征

3 納入研究的質量評價

共納入19項研究，根據SYRCLE的偏倚風險工具，納入研究的偏倚風險為3～5分（總 10 分）。2項研究獲得3分（10.53%）；15項研究獲得4分（78.95%）；2項研究獲得5分（10.53%）。見表2。

表2 納入研究的方法質量學評估

4 Meta分析的各項結果

4.1 DUF大鼠創面組織VEGF蛋白水平 納入的10篇文獻[20，22-24，27-30，35，37]報道了創面組織VEGF蛋白水平。異質性檢驗顯示兩組間異質性顯著（P＜0.00001，I2＝84%），采用隨機效應模型進行Meta合成。結果 顯示，2組比較差異有統計學意義[SMD =1.39，95%CI（0.67，2.10），P=0.000 2]，表明相比于對照組，中藥外用能夠促進創面組織中VEGF蛋白水平的表達。見圖2。同時根據對照組干預措施進行亞組分析，Meta分析顯示：相比于常規換藥組和抗生素換藥組，中藥外用促進DU大鼠創面VEGF蛋白表達的優勢明顯[SMD =2.02，95%CI（1.27，2.78），P=0.000 2；SMD=2.06，95%CI（0.16，3.96），P=0.03]；但是相比于生長因子換藥組，二者相比較無明顯統計學差異，尚不能證明中藥外用組在促進DU大鼠創面VEGF蛋白水平表達方面優于生長因子換藥組[SMD =0.04，95%CI（-0.52，0.61），P=0.88]見圖3。

圖2 兩組創面組織VEGF蛋白水平Meta分析圖

圖3 兩組創面組織VEGF蛋白水平亞組分析Meta分析圖

4.2 DUF大鼠創面組織VEGF mRNA水平 4項研究[30-32，34]報告了血清VEGF表達量，分析顯示4項研究間統計學異質性較大（P＜0.000 01，I2=97% ），故采用隨機效應模型進行Meta分析。結果 顯示：中藥外用治療組較對照組能明顯提高DU大鼠組織中VEGF mRNA表達量，差別有統計學意義[SMD =5.53，95%CI（0.58，10.11），P=0.03]。見圖4。

圖4 兩組創面組織VEGF mRNA水平Meta分析圖

4.3 DUF大鼠創面血清VEFG因子水平 7項研究[21，25-26，30，33，36，38]報告了血清EGF表達量，分析顯示7項研究間統計學異質性較大（P＜0.000 01，I2=89% ），故采用隨機效應模型進行Meta分析。結果 顯示：中藥外用治療組較對照組能明顯提高DU大鼠血清中VEGF的表達量，差別有統計學意義[SMD =1.91，95%CI（0.73，3.09），P=0.002]。見圖5。

圖5 兩組血清VEGF水平Meta分析圖

4.4 HIF-1α/VEGF/VEGFR-2信號通路相關因子表達水平 3項研究[24，27，37]報告了DUF大鼠創面組織中HIF-1α蛋白表達量，分析顯示3項研究間統計學異質性較大（P=0.008，I2=79% ），并考慮臨床異質性，故采用隨機效應模型進行Meta分析。結果 顯示：中藥外用治療組較對照組能明顯DU大鼠創面組織中HIF-1α蛋白表達量，差別有統計學意義[SMD=2.35，95%CI（1.11，3.59），P=0.000 2]。2項研究[22，24]報告了DU大鼠創面組織中VEGFR-2蛋白表達量，分析顯示2項研究間統計學異質性較大（P=0.002，I2=89% ），并考慮臨床異質性，故采用隨機效應模型進行Meta分析。結果 顯示：中藥外用治療組較對照組能明顯DU大鼠創面組織中VEGFR-2蛋白表達量，差別有統計學意義[SMD =4.52，95%CI（0.63，8.42），P=0.02]。見圖5，圖6。

圖6 兩組創面組織HIF-1α蛋白水平Meta分析圖

圖7 兩組創面組織VEGFR-2蛋白水平Meta分析圖

4.5 PI3K/AKT信號通路相關因子表達水平 1項研究[34]報告了DUF大鼠創面組織中PI3K蛋白表達量，其研究表明中藥外用治療組較對照組能明顯抑制DU大鼠創面組織中PI3K蛋白表達量，差別有統計學意義[SMD =-0.94，95%CI（-1.08，-0.80），P=0.00001]。1項研究[27]報告了DU大鼠創面組織中AKT蛋白表達量，其研究表明中藥外用治療組較對照組能明顯促進DU大鼠創面組織中AKT蛋白表達量，差別有統計學意義 [SMD =0.28，95%CI（0.22，0.34），P＜0.000 01]。

4.6 Wnt/β-catenin信號通路相關因子表達水平1項研究[36]報告了DUF大鼠創面組織中β-catenin蛋白表達量，其研究表明中藥外用治療組較對照組能明顯促進DU大鼠創面組織中β-catenin蛋白表達量，差別有統計學意義[SMD =0.23，95%CI（0.19，0.27），P＜0.000 01]。1項研究[36]報告了DU大鼠創面組織中GS3K-β蛋白表達量，其研究表明中藥外用治療組較對照組能明顯促進DU大鼠創面組織中GS3K-β蛋白表達量，差別有統計學意義 [SMD =0.44，95%CI（0.06，0.82），P=0.02]。1項研究[36]報告了DU大鼠創面組織中Cym-c蛋白表達量，其研究表明中藥外用治療組較對照組能明顯抑制大鼠創面組織中Cym-c蛋白表達量，差別有統計學意義[SMD =-0.47，95%CI（-0.72，-0.22），P=0.000 2]。

5 發表偏倚

結局指標中DUF大鼠創面組織VEGF蛋白水平研究納入10項，通過漏斗圖初步判斷是否存在發表偏倚，結果顯示各研究點在漏斗圖兩側分布不對稱，提示可能存在發表偏倚，其偏倚的發生可能于研究的年份，研究的造模方法，對照組干預措施，實驗室的工作環境，試劑、儀器的不同型號以及研究人員的主觀判斷等因素有關。結果 見圖8。

圖8 兩組創面組織VEGF蛋白水平漏斗圖分析

討 論

1 DFU與VEGF的中西醫研究進展

血管生成是指現存的血管出芽形成新的血管從而恢復創面組織的血液和氧氣供應[39]，這個過程在創面修復中的重要性不言而喻。血管生成減少不僅導致創面氧氣和營養物質的供應不足，而且使經新生血管進入創面的其他修復細胞減少，是創面難以愈合的重要原因。在DFU中，因患者高血糖帶來的局部血流動力學異常，伴隨著周圍神經病變、代謝紊亂、慢性炎癥、氧化應激、以及內皮功能障礙等一系列問題，導致創面區域存在血管灌注不足、細胞生長因子分泌減少，血管的生成受損，使得DFU創面相較于其他慢性創面更加遷延難愈[40]。因此，促進DFU患者局部創面中的生長因子分泌，促進創面肉芽組織中血管生成，改善創面局部血流供應，是幫助DFU傷口愈合的重要手段[41]。

VEGF是一種與血管生長相關的特異性生長因子，是肝素結合性雙價蛋白，正常條件下由中性粒細胞及血小板分泌，在缺氧條件下由角質形成細胞和上皮細胞分泌[42]。VEGF在正常人體皮膚組織中表達較少，在機體創傷時則大量釋放。其可以與內皮細胞表面的特異性受體結合，有效刺激細胞的有絲分裂，使其增殖，從而促進新生血管的生成；也可以增加血管的通透性，使血管內成分滲漏，給血管內皮的形成和遷移提供基質，進而上調血管的生成。創面血管形成決定創面愈合速率及質量。VEGF在維持和恢復內皮細胞的完整性中發揮重要作用，還可增加側枝循環血量，起到保護作用；還能刺激肉芽組織及上皮的形成、角質形成細胞和成纖維細胞的移行，進而促進潰瘍面愈合[43]。

DFU屬中醫學“消渴脫疽”“筋疽”“瘡瘍”等范疇，多發于老年人或素體虧虛的患者。屬本虛標實之證，發病與濕熱、痰濁、火毒、氣滯血瘀及氣虛、陰虛等關系密切。因虛感邪，邪氣致瘀，瘀阻傷正，化腐致損為其病理過程。中藥外用治療糖尿病足潰瘍由來已久，所謂“腐肉不去，新肉不生”，其核心理論基礎為“祛腐生肌”之法。魏子孝[44]強調糖尿病足潰瘍愈合是“腐祛肌生，肌平皮長”的過程，提出“給邪出路，祛腐生肌”中西醫結合外治的方法。闕華發[45]認為“虛”“邪”“瘀”為該病變化之機，并提出“祛瘀化腐”“活血生肌”外治法理論。呂延偉[46]組方治以摻藥、圍藥、熏洗藥、油膏等調和后敷于局部皮膚壞死邊緣，對于控制壞疽發展，促其分界，提出了“引邪外出，祛腐生新”的外治原則。以上可以看出，濕、熱、痰、瘀、毒、濁統稱為“腐”，腐邪阻絡、營衛不和，經脈、絡脈 閉塞是主要病機[47]。而“新肉”可以指新生的血管、皮膚、組織、肌肉，從我們本文的研究來看，VEGF在幫助DFU創面血管肉芽新生、組織皮膚生長、細胞纖維增殖方面效果顯著。同時，我們發現外用中藥通過多條信號通路發揮作用，激活DFU創面及血清中VEGF的表達，是中醫“祛腐生肌”理論在創面中發揮作用的核心細胞因子。

2 VEGF與HIF-1α/VEGF/VEGFR-2、PI3K/AKT、Wnt/β-catenin信號通路

在糖尿病足潰瘍中，有缺氧→HIF-1α→VEGFVEGFR-2這一調控鏈存在。缺氧誘導因子（HIF-1α）是一種關鍵轉錄因子，它具有氧濃度依賴性，能夠調控包括VEGF在內的多個靶基因，進一步調控由于缺氧誘導的多種機體適應性反應，比如新血管的生成、代謝和細胞凋亡[48]。從機制上，由于局部組織的缺氧和缺血，激活人體內源性的防御和修復機制，從而導致缺氧反應的轉錄復合物 HIF-1α 的增加，影響糖代謝，上調 HIF-1α 誘導基因 VEGF 的表達[49-50]，促進血管的新生，從而改善缺血缺氧癥狀。目前為止，已發現有3種VEGF受體存在人體中，其中血管內皮生長因子受體-2（Vascular endothelial growth factor Receptor-2，VEGFR-2）分布在血管內皮細胞，它的主要作用是與VEGF藕聯，以此介導血管內皮細胞的分 裂和增生，激活血管內皮細胞的遷移能力，增加血管的通透性等[51]。由此可見HIF-1α→VEGFVEGFR-2這一信號通路在促進內皮細胞的增殖、遷移及血管的生成等方面發揮著重要作用。

PI3K/AKT信號轉導通路是執行細胞黏附、向外遷移和血管生成等功能的中心環節[52]。多種生長因子可通過激活PI3K/AKT信號轉導通路促進血管生成[53-54]。磷脂肌醇3-激酶（phosphninositide3-kinase，PI3K）是細胞內蛋白激酶的一種，與細胞的增殖分化、葡萄糖分子的轉運等密切相關。如PI3K下游的靶分子磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸酯可通過募集并調節蛋白激酶B（proteinkinase B，Akt）等多種效應因子，控制血管新生相關蛋白質的合成、細胞的增殖和遷移等[55]。Bhattacharya D等[56-57]的研究顯示，VEGF與其受體-2結合后可通過正反饋調節PI3K/Akt信號通路，進一步促進AKT的活化而參與調控血管內皮細胞的增殖以及創面血管的新生。

Wnt/β-catenin通路對細胞的多種生物學行為均具有調控作用，上游信號分子Wnt 1將生物信號傳入細胞后，細胞內GSK-3β對β-catenin的降解活性減弱并引起β-catenin堆積，進而通過β-catenin的生物學活性來發揮促生長、抗調亡的作用[58]。β-catenin在細胞內蓄積后能夠調控多種細胞因子的表達和分泌，包括多種具有促生長作用的細胞因子。趙亞男等[59]的研究在糖尿病大鼠中發現：DF創面內受抑制的Wnt /β-catenin通路能夠影響創面內細胞的生長，進而阻礙創面的修復，包括VEGF在內的眾多生長因子的含量明顯降低且與 Wnt 1、β-catenin呈正相關，與GSK-3β呈負相關[60]。

由此可見，以上三條信號通路在DFU的愈合過程中，均可以通過上下游分子的調控，影響促進VEGF的表達。本研究則發掘了目前中醫祛腐生肌外治法分子研究機制的相關文獻，初步證明其可能是通過激活以上信號通路，正反饋上調VEGF因子的表達，從而促進DFU傷口的愈合。

3 研究的局限性

本研究主要異質性存在于治療組干預措施方面，中藥外用的劑型、用藥、功效等均有不同，但其核心理論都是“去腐生肌”法，其異質性在可接受范圍內。在對照組方面，我們針對其用藥種類不同進行了亞組分析，對異質性進行了定性。但是，在包括造模方法、換藥間隔、換藥天數、大鼠種類等方面也存在異質性，考慮其影響較小，未作處理。另外，本研究納入語種僅為中文和英文，而英文文獻未有一篇進入最終Meta分析，大多數研究質量偏低，總樣本量偏少，且考慮納入研究中，因實驗環境、實驗器械、主觀操作、統計方法等不同，造成Meta合并結果偏倚的可能性較高。因此，結論的確切性仍需要更大的樣本，更合理的設計以及高質量的動物實驗研究來進行進 一步的驗證。

總結與展望

祛腐生肌外治法歷史悠久，其理論體系完善，劑型選擇性多，工藝較為成熟，臨床療效滿意。本次研究驗證中藥外用對DFU大鼠模型中VEGF表達的影響作用，包括血清VEGF分子表達、創面VEGF mRNA表達及創面VEGF蛋白表達。相對于常規換藥組及抗生素換藥組，中藥外用促進VEGF表達的效果明顯，但是與生長因子換藥組相比，中藥外用無明顯優勢。其機制與調節HIF-1α/VEGF/VEGFR-2、PI3K/AKT、Wnt/β-catenin信號通路密切相關。但其部分制劑易對皮膚刺激性較大，易造成皮膚色素沉著，甚至有加重疼痛感，產生皮膚毒性，造成肝腎損害的可能。因此，我們仍需要更多大樣本、高質量、設計更合理的實驗來進一步驗證療效，并評估其安全性標準。同時，也需要更多基礎實驗對祛腐生肌法治療糖尿病足創面的藥理活性成分、分子作用靶點等進行更加深入的研究挖掘。