喂食二氫楊梅素對高脂日糧小鼠生長代謝及發情周期的影響

謝梅英，侯連杰

（1.廣東生態工程職業學院，廣東廣州 510520；2.廣州醫科大學附屬第六醫院-清遠市人民醫院，廣東清遠 511518）

在動物生產中，脂肪沉積會影響母豬繁殖性能，如降低發情率、受胎率和仔豬出生成活率等[1]。此外，肥胖會引起飼養動物內分泌及代謝異常，如代謝率降低、高胰島素血癥和孕酮產生過剩[2]，伴隨著發情周期紊亂[3]、多囊卵巢綜合征[4]和不孕癥[5]等。因此，預防肥胖可以提高畜禽繁殖性能，降低生殖疾病發病率，改善動物繁殖性能。

二氫楊梅素又稱蛇葡萄素、白蘞素、雙氫楊梅樹皮素、雙氫楊梅素等，是一種綠色安全二氫黃酮醇類黃酮植物提取物[6]。其廣泛存在于蛇葡萄科蛇葡萄屬植物中，在藤茶中含量可以達到30%，也存在于楊梅科、杜鵑科、藤黃科等植物中[7]。既往研究證實，二氫楊梅素通過激活AMPK、NRF2 和NF-κB 等通路發揮抗氧化[8]、抗炎[9]、降血糖及調血脂等多方面的作用[10-11]。然而，二氫楊梅素是否能夠緩解高脂日糧導致的動物發情周期紊亂尚不清楚。本試驗旨在探究二氫楊梅素對高脂日糧導致的小鼠發情周期紊亂的影響，研究結果有望揭示二氫楊梅素在改善肥胖相關生殖異常方面的調控作用，為其在改善動物繁殖性能和人類健康中的應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和試驗設計

36 只6 周齡C57B/L6 雌性小鼠（廣東省醫學實驗動物中心），在22～28 ℃、60%～80%濕度的條件下，12 h 的光/暗循環，適應1 周后，將小鼠隨機分為3 組（n=12）：正常日糧組、高脂日糧飲食組和“高脂日糧飲食+二氫楊梅素”組。正常日糧飼喂標準嚙齒動物飼料（AIN-93G），高脂日糧飲食組飼喂高脂日糧（脂肪提供60%能量），高脂日糧飲食+二氫楊梅素組飼喂高脂日糧（脂肪提供60%能量）并灌喂200 mg·kg-1體重的二氫楊梅素溶液，正常日糧和高脂日糧飲食組每天灌喂等體積的PBS。試驗期18 周，在不同飼養階段，對小鼠體組成、直腸（體核）溫度和發情周期等進行檢查。試驗結束后，用CO2麻醉小鼠，眼球取血分離血清，用ELISA 試劑盒檢測雌二醇（estradiol，E2），促卵泡生成素（follicle-stimulating hormone，FSH）水平。

1.2 材料和試劑

二氫楊梅素購買自MCE 公司（HY-N0112）。FSH和E2檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 體組成檢測

從12周齡開始每周一上午9:00用動物體成分和核磁共振成像系統分析儀（Body Composition Analyzer MiniQMR23-060H-I,Niumag Corporation,Shanghai,China）測定小鼠的體脂含量和脂肪分布。

1.4 整體代謝

按照綜合實驗動物監測系統（Promethion metabolic screening systems，美國Systems International 公司）操作指南，測定20周齡小鼠的產熱和耗氧量等代謝參數。

1.5 組織RNA提取和實時熒光定量PCR檢測基因表達

按照廣州美基生物科技公司RNA 快速提取試劑盒操作說明提取腹股溝白色脂肪和肩胛間褐色脂肪RNA。按照TaKaRa 公司逆轉錄試劑盒操作說明將組織總RNA 逆轉錄為cDNA 用于后續定量PCR 實驗。實時熒光定量PCR 實驗操作在本團隊前期發表研究中均有報道，相關基因引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.6 Western Blot檢測基因的蛋白含量

使用RIPA 裂解液裂解脂肪組織，12 000 r·s-1離心10 min 獲得組織蛋白溶液，使用BCA 法測定蛋白濃度。蛋白變性后利用Western Blot 檢測基因的蛋白含量，Western Blot 實驗方法參照本團隊前期發表研究。

1.7 直腸溫度測定

從8 周齡開始每天用小鼠用直腸探頭連接數字溫度計測量小鼠的直腸溫度。

1.8 發情周期鑒定

對20 周齡雌性小鼠連續8 天進行陰道涂片的細胞學檢查，每天觀察1 次陰道涂片細胞類型，確定發情周期所處階段。固定小鼠，用移液槍吸取20 μL PBS至小鼠陰道，反復抽吸5 次，將液體均勻涂至整個載玻片，涂片風干后，甲醇固定3 min，瑞氏染液染色6 min，PBS 輕柔沖洗，吉姆薩染液染色8 min，最后用自來水漂洗，自然干燥后封皮檢測。各階段的分辨方法如下：發情間期黃體退化，可見大量白細胞及少量黏膜和上皮細胞；發情期卵泡成熟排卵，為無核角化細胞包含少量上皮細胞；發情前期卵泡快速生長，可見大量有核上皮細胞和少量角化細胞；發情后期黃體生成，為一半上皮細胞和一半白細胞。

1.9 蘇木精&伊紅（H&E）染色

分離內臟脂肪，用4%多聚甲醇固定48 h，脫水后用石蠟包埋切片，用蘇木精和伊紅染色并拍照。

1.10 統計分析

所有數據均以“平均值±標準誤”表示。使用SPSS 22.0軟件進行統計分析。采用單因素方差分析對各組均值進行差異分析，p＜0.05為有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 二氫楊梅素對高脂日糧誘導的小鼠脂肪沉積的影響

與正常日糧相比，18 周的高脂日糧飼喂顯著增加小鼠體增重和小鼠脂肪含量，喂食二氫楊梅素可顯著逆轉高脂日糧誘導的體增重和脂肪含量的增加（見圖1A、1B）。與此同時，內臟脂肪的H&E 染色結果表明：與正常日糧相比，高脂日糧飼喂顯著增加小鼠的內臟脂肪細胞脂質蓄積，二氫楊梅素顯著逆轉了高脂日糧誘導的內臟脂肪細胞脂質累積（見圖1C）。

圖1 喂食二氫楊梅素對小鼠體增重和脂肪沉積的影響

2.2 二氫楊梅素對高脂日糧導致的雌性小鼠發情周期紊亂的影響

與正常日糧相比，高脂日糧誘導肥胖小鼠發情周期顯著增長（見圖2A、2B），而且降低發情期的時間比例，增加發情間期的時間比例（見圖2D）；而喂食二氫楊梅素將小鼠發情周期恢復到正常天數（見圖2B、2C），并且逆轉高脂日糧導致的發情期縮短和發情間期延長（見圖2D）。雌二醇和促卵泡激素的ELISA 檢測結果表明：肥胖小鼠體內雌二醇和促卵泡激素水平顯著降低，二氫楊梅素能夠改善高脂日糧對血清雌二醇和促卵泡激素水平的抑制作用（見圖2E、2F）。上述結果表明，二氫楊梅素可以改善高脂日糧導致的雌性小鼠發情周期紊亂。

圖2 喂食二氫楊梅素對小鼠發情周期的影響

2.3 二氫楊梅素對肥胖雌性小鼠能量代謝的影響

為探究二氫楊梅素緩解高脂日糧導致的發情周期紊亂是否與提高機體基礎能力代謝有關，本研究測定了喂食二氫楊梅素對肥胖小鼠的基礎代謝的影響。結果顯示，高脂日糧降低小鼠的耗氧量和產熱量，而二氫楊梅素逆轉了高脂日糧引起的耗氧量和產熱量的降低（見圖3A、3B）。同時，二氫楊梅素使小鼠的直腸溫度顯著升高，與能量代謝增加的表型一致，表明二氫楊梅素提升肥胖雌性小鼠的能量代謝。

圖3 喂食二氫楊梅素對小鼠能力代謝的影響

2.4 二氫楊梅素對肥胖小鼠的棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化相關基因表達的影響

由于棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化與增加小鼠產熱密切相關，因此本試驗探究了二氫楊梅素對棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化的影響。定量PCR 結果（見圖4）表明：高脂日糧抑制棕色脂肪激活相關基因UCP1、PGC-1α、Cidea 和PRDM16 的表達，二氫楊梅素逆轉高脂日糧對棕色脂肪激活相關基因的抑制作用；WB結果與qPCR結果一致。此外，定量PCR結果表明：高脂日糧抑制腹股溝白色脂肪棕色化轉變相關基因UCP1和PGC-1α mRNA 水平，二氫楊梅素顯著逆轉高脂日糧對腹股溝白色脂肪棕色化轉變相關基因的抑制作用，且WB 結果與定量PCR 結果一致。上述結果表明，二氫楊梅素促進肥胖小鼠的棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化相關基因表達。

圖4 二氫楊梅素促進肥胖小鼠的棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化相關基因表達

3 討論與結論

3.1 討論

已有研究表明，肥胖或高脂日糧會損害包括發情周期紊亂在內的雌性動物繁殖性能[12]。本研究同樣發現高脂日糧導致雌性小鼠發情周期紊亂。本研究結果顯示：小鼠灌服二氫楊梅素可以緩解高脂日糧導致的肥胖小鼠發情周期紊亂。

雌性動物發情周期是其繁殖過程的重要組成部分，受生殖激素的嚴密調控，不規律的發情周期往往伴隨著促卵泡激素和雌二醇等生殖激素水平的紊亂[13]。有研究報道，肥胖女性血清促卵泡激素和雌激素濃度較低；在嚙齒類動物中，卵巢切除術導致肥胖發生，而補充雌激素可抑制肥胖的發生[2]。有趣的是，雌激素可抑制動物的采食行為，而較低雌激素水平將誘導動物采食，進一步誘導肥胖[14]。有研究表明，雌性的發情行為與體脂含量密切相關；機體能量平衡和發情周期受到下丘腦神經元的嚴格調控，高脂日糧可以穩定地提高哺乳動物雌二醇水平，雌二醇抑制促性腺激素促黃體生成激素分泌，導致動物發情表現差[15]。另有研究表明，當高脂日糧引起大鼠肥胖時（體重增加27%），可導致98%的大鼠發情中斷[16]。本研究中發現二氫楊梅素處理后，可顯著升高小鼠雌激素水平，并恢復小鼠正常的發情周期。在本研究中發現高脂日糧誘導肥胖的小鼠體內促卵泡激素和雌激素水平顯著降低，二氫楊梅素改善肥胖對促卵泡激素和雌激素分泌的抑制作用，提示二氫楊梅素可預防高脂日糧導致的肥胖雌性小鼠生殖激素水平的改變。

本研究還進一步解析了二氫楊梅素緩解肥胖引起的發情周期紊亂的機制。鑒于肥胖往往伴隨著能量平衡的變化，本研究通過檢測小鼠機體代謝產熱結果發現：二氫楊梅素增加了高脂日糧誘導肥胖小鼠的基礎耗氧量和產熱量。由于哺乳動物的基礎產熱量的增加主要通過棕色脂肪和棕色化的白色脂肪中解偶聯呼吸作用實現[17]，因此，本研究檢測了小鼠棕色脂肪和白色脂肪中解偶聯蛋白UCP1 的表達變化，結果發現高脂日糧抑制UCP1 在棕色脂肪和白色脂肪中的表達，但二氫楊梅素顯著增加UCP1 的表達。本研究團隊前期證明二氫楊梅素能夠激活PGC-1α 信號通路抑制肥胖小鼠脂肪組織炎癥反應，改善小鼠胰島素敏感性[18]；而PGC-1α 是棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化過程中重要轉錄因子，可促進UCP1 的表達[19]。本研究也表明：二氫楊梅素可顯著增加棕色脂肪和白色脂肪組織PGC-1α 的表達，提示二氫楊梅素通過激活PGC-1α/UCP1信號通路，促進脂肪組織的解偶聯呼吸作用，增加小鼠代謝產熱，從而改善肥胖引起的發情周期紊亂。

3.2 結論

喂食二氫楊梅素可緩解高脂日糧誘導肥胖所導致的小鼠發情周期紊亂和代謝產熱降低，其可能與棕色脂肪激活和白色脂肪棕色化產熱相關。本研究揭示了二氫楊梅素在改善動物肥胖相關的生殖異常方面的潛在應用，可為其在人類生殖疾病治療和動物繁殖性能改善中的應用提供一定的試驗依據。