長江水系中華絨螯蟹背甲幾何形態的產地差異

唐 靜,薛竣仁,劉洪波,姜 濤,陳修報,楊 健,

( 1.南京農業大學 無錫漁業學院,江蘇 無錫 214081;2. 中國水產科學研究院 淡水漁業研究中心 漁業微化學研究室,江蘇 無錫 214081 )

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)俗稱大閘蟹、河蟹,屬節肢動物門甲殼總綱十足目絨螯蟹屬[1],其具有生長快、肉質鮮嫩、營養及經濟價值高等特點[2-3]。由于其水產品資源生物的分布地區及生長環境不同,其在外部形態等品質方面可出現地理性的差異[2,4-5]。這種差異在不同產地的大閘蟹上亦有發現[6]。由于一段時期以來假冒知名產地大閘蟹的事件頻發[7-8],著力研究和開發可快速且非致死地辨別大閘蟹產地的辦法對相關產業的有序發展意義重大。近年來,針對中華絨螯蟹的背甲(頭胸甲)的研究越來越受到關注。該近六邊形鈣質結構硬組織的邊緣總體上可分為前緣、眼緣、前側緣、后側緣和后緣5部分。前緣正中為額部,有4枚齒突,稱額齒,額齒中間的凹陷,以中央的一個為最深;左右前側緣各有4個銳齒,稱側齒;背甲后側緣斜向內側,后緣與腹部交界,比較平直;背甲中部有呈M型的花紋[9]。關注這些形態上的產地適應性變化有利于開展大閘蟹產地溯源和辨別的研究[7]。物種形態學變異可受遺傳因素和環境因素等影響,在敞水和淺水環境中養殖湖沼型和底棲型太陽魚(Lepomisgibbosus),比較其遺傳變異和表型可塑性對魚形態變化權重的研究發現,養殖環境差異所導致的表型可塑性形態學變異貢獻率達53%,遠大于由遺傳分化所造成的貢獻率(14%)[5]。因此養殖環境差異導致的形態學變異更需得到重視。

幾何形態測量學是主要基于二維或三維形態結構上符合特定定義的同源地標點及其精密的數據系統,來破解形態差異性及其動態和可視化的學科[10]。該法所選取的地標點是具有明顯特征且容易辨識的點,且后續可視化處理時可以消除在選取時會發生的位置、取向和比例上的非形態變化的干擾[11]。鄭朝臣等[6]首次嘗試引入該幾何形態測量學分析法研究了中華絨螯蟹背甲及腹甲形態的產地差異性,發現基于雌、雄蟹背甲形態的產地判別準確率可高達100%,與以往通過地理元素“指紋”方式所能夠達到的判別準確率[12-14]類似。近期,利用該法分別對不同國家和我國不同水系野生中華絨螯蟹的背甲形態特征差異所開展的研究也取得了較為滿意的判別效果[15-18]。然而,基于幾何形態測量學的大閘蟹外型及其產地(特別是同一水系,如長江)精細尺度的判別研究較少;其相關理論基礎數據仍需完善,且其應用方面的可行性仍需進一步驗證。鑒于此,筆者以長江水系中安徽、江蘇7個產地中華絨螯蟹背甲作為研究對象,對其產地間的幾何形態測量學差異性特征開展了較為詳細的研究,以期為建立我國各知名產地中華絨螯蟹背甲的幾何形態測量學鑒別手段提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所選用的長江水系中華絨螯蟹樣本分別于2017年10月采自長江中游地區的湖南大通湖,2018年11月采自長江下游地區的安徽黃陂湖、女山湖、沱湖,2017年12月采自長江無為江段,2017年11月采自江蘇溱湖、石臼湖7個產地(表1)。除無為江段的蟹為長江的野生個體外,其余蟹均為放養或圍網養殖于相應湖區的個體(苗種均為購自江蘇南通繁育場的長江水系扣蟹,種質資源遺傳背景相同)。本試驗中所采集各湖區產地的養殖蟹均符合國標GB/T 19957-2005所標準定義的原產成蟹(至少從扣蟹養到成蟹這一過程保持在同一水域內)的要求。至采樣時,各產地蟹均為商品規格成蟹,已完成全部蛻皮過程[19]。各產地蟹采集后均盡快運回實驗室,并活體進行常規及幾何形態學測量。

表1 長江水系7個不同產地中華絨螯蟹群體的形態測量信息

1.2 試驗方法

1.2.1 地標點的建立與提取

地標點主要分為3類, 即以不同組織間交點為特征的Ⅰ型地標點, 以結構中凹陷或凸起點為特征的Ⅱ型地標點和以結構極值點為特征的Ⅲ型地標點[11]。依據幾何形態測量學的地標點選取原則,在蟹背甲上選取了Ⅱ型地標點(33個)和Ⅲ型地標點(2個)共35個(圖1、表2)。在LED燈光(6 W)條件下,利用三腳架設定拍攝固定高度(24 cm)的Nikon COOLPIX P6000數碼相機,進行蟹背甲拍照。將拍好的照片導入Adobe Photoshop 13.0軟件后,再利用tpsDig2軟件[20]進行地標點的標記,獲取地標點的x、y坐標值,建立二維地標點的數據文件。

表2 地標點類型與定義

1.2.2 平均形與薄板樣條分析

地標點的原始坐標數據包含了許多非形態變異。利用tpsRelw軟件[21]普氏疊加運算來消除上述非形態變異,得到標準化數據并求出平均型,以用于后續的判別分析。依據標準化數據的相對扭曲分析獲得35個地標點的貢獻率[22]。利用tpsRegr軟件[23]進行薄板樣條分析[24-25],繪出各產地中華絨螯蟹網格變形圖,進行差異比較。

1.2.3 判別分析

將經tpsRelw軟件得到的相對扭曲得分導入Excel表格,采用Bayes方法[26]進行判別分析。將所有自變量納入SPSS 23.0軟件判別函數進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 背甲形態的可視化差異分析

利用tpsRelw軟件根據地標點數據文件計算得到背甲形態的平均形(圖2),再通過絕對扭曲、回歸分析和置換檢驗進行網格化和差異矢量化后構建網格圖(圖3、圖4)。在對7個產地中華絨螯蟹背甲地標點數據進行的地標點法分析中,雄蟹貢獻率最高的地標點分別為第11、12、16、17地標點,共解釋了63.26%的形態差異,其他31個地標點解釋了36.74%的形態差異;雌蟹貢獻率最高的地標點分別為第11、12、16、17地標點,共解釋了60.21%的形態差異,其他31個地標點解釋了39.79%的形態差異。

圖2 中華絨螯蟹背甲平均形Fig. 2 Average shape of the Chinese mitten crab E. sinensis carapace

圖3 中華絨螯蟹雄蟹背甲網格變形圖與變異可視化(變異擴大10倍)Fig. 3 Mesh deformation map and variation visualization (with 10 times magnification) for the carapace of male E. sinensis from different geographical origins

圖4 中華絨螯蟹背甲網格變形圖與變異可視化(變異擴大10倍)Fig. 4 Mesh deformation map and variation visualization (with 10 times magnification) for the carapace of female E. sinensis from different geographical origins

對雄蟹背甲(圖3)而言,大通湖蟹、溱湖蟹、石臼湖蟹與平均形相比,其額緣(第2、3、25、26地標點)整體向下偏移,中腮區左側孔(第28地標點)向右上伸展,中腮區右側孔(第33地標點)向上方伸展。大通湖蟹的M型花紋上除下頂點(第30地標點)基本無變化外,其余花紋各點向右上方伸展,花紋變大變寬;而溱湖蟹和石臼湖蟹的M型花紋下頂點(第30地標點)向右上伸展,較花紋上其余各點(第29、31、34、35地標點)向右上方伸展程度小,花紋整體變大變寬。

黃陂湖蟹、女山湖蟹、沱湖蟹的中腮區左側孔(第28地標點)向左下伸展,中腮區右側孔(第33地標點)向下伸展。黃陂湖蟹、女山湖蟹的額緣(第2、3、25、26地標點)及額緣中心(第1地標點)與平均形相比整體向上平移,M型花紋上除下頂點(第30地標點)向左下方略微偏移,其余點均向M型中心聚集,花紋整體變小。但沱湖蟹的M型花紋上除下頂點(第30地標點)基本無變化外,其余各點(第29、31、34、35地標點)向M型中心聚集,花紋變小。

安徽無為長江江段的野生蟹和平均形相比,背甲形態則無明顯的區別。

對雌蟹背甲(圖4)而言,大通湖河蟹、溱湖蟹和石臼湖蟹的額緣(第2、3、25、26地標點)及額緣中心(第1地標點)與平均形相比整體向下平移,凹陷更大。中腮區兩孔(第28、33地標點)與平均形相比向上偏移,M型花紋上各點整體向上平移,M型花紋斜豎向伸展,花紋整體更細長。后側緣凹點(第13、15地標點)和殼長的下頂點(第14地標點)向左下移動,背甲底部變寬大。但其中石臼湖蟹的額緣與第1側齒之間的凹點(第4、24 地標點)分別向內側移動,與額緣之間距離變小。第四側齒內側頂點(第11、17地標點)、第四側齒外側頂點(第12、16地標點)向內下方縮短,側齒變小。

黃陂湖蟹、女山湖蟹和沱湖蟹的額緣(第2、3、25、26地標點)及額緣中心(第1地標點)與平均形相比整體向上平移,頂端更尖細。中腮區2孔(第28、33地標點)與M型花紋上各點整體向下平移,后側緣凹點(第13、15地標點)和殼長的下頂點(第14地標點)向M型花紋方向移動,兩者之間距離縮短。

安徽無為長江江段的野生蟹和平均形相比,背甲形態亦無明顯變化。

2.2 背甲形態差異的判別分析

對7個產地間雌、雄蟹的背甲進行判別,準確率均高達100%。判別分析散點圖(圖5)更直觀地顯示出蟹背甲形態地標點法的應用結果在視圖上也能明顯且有效地顯示出判別結果良好。

將每個產地的雌、雄蟹作為一個整體,進行僅7個產地間中華絨螯蟹背甲幾何形態的判別分析,準確率為98.4%(表3),判別分析散點圖(圖6)顯示判別效果差于區分性別的判別結果。

表3 基于背甲形態的7產地中華絨螯蟹判別分析

3 討 論

3.1 中華絨螯蟹背甲的幾何形態測量學產地差異特征

筆者利用基于地標點的幾何形態測量法來判別同屬長江水系7個不同產地養殖和野生中華絨螯蟹形態差異,取得了滿意的結果。試驗結果表明,湖南、安徽、江蘇3個省份間和各省內不同產地間蟹的背甲形態上均存在差異。與平均型相比較:安徽黃陂湖蟹、女山湖蟹、沱湖蟹背甲形態有同趨勢變化,額齒和側齒更尖長,M型花紋變小,背甲后緣縮小;湖南大通湖蟹和江蘇溱湖蟹、石臼湖蟹背甲形態有同趨勢變化,額齒和側齒變短,M型花紋變大,背甲后緣變寬大;安徽無為長江江段野生蟹背甲形態則與蟹的平均形態差異不顯著。7個產地間雌、雄蟹的背甲形態判別準確率均可達100%。關于長江水系太湖、洪澤湖、高寶湖、長蕩湖、陽澄湖,巴城、興化“泓膏”養殖水域,長江口崇明自然水域等產區所產蟹的背甲形態的研究結果同樣表明,中華絨螯蟹背甲的第1側齒、M型花紋以及背甲底部存在顯著差異[6]。關于長江、黃河、遼河、甌江、閩江及圖們江野生中華絨螯蟹和荷蘭野生中華絨螯蟹背甲形態特征的研究結果[15-16]也與上述發現一致。

本研究中不同產地間中華絨螯蟹體質量有一些明顯的差異。但至9月之后個體均為商品規格的成蟹,對背甲產地適應性變化影響最大的蛻皮過程已全部完成,故此階段養殖過程中背甲形態對產地環境的適應性變化已趨于穩定。已有研究表明,雖然不同產地蟹的體質量有差異,但未觀察到對背甲形態產地差異性的影響[6-7,18-19]。因此,筆者認為蟹體質量上的差異將不會影響分析的結果和準確性。

同樣,遺傳因素亦不會影響到本研究結果的客觀性。由于本研究中無為群體本身就是長江野生蟹,而另6個養殖產地苗種均為購自江蘇南通繁育場的長江水系扣蟹,故相關7個產地蟹的種質資源遺傳背景相同,不存在遺傳多樣性導致背甲形態差異性的問題。不同生境應該是導致其產出中華絨螯蟹背甲形態差異的最主要因素。黃朝輝等[27]在關于三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)蛻殼周期肝胰腺、外殼和鰓中鈣含量的變化研究中發現,當蟹殼完全硬化后(從完全硬化至下一次蛻殼期間),蟹殼中鈣含量將不再發生變化,其新殼硬化所需的鈣主要來自周圍環境;Greenaway[28]也綜述了甲殼動物中的這種現象。蟹殼中含有碳酸鈣、甲殼質等物質[29],在蛻皮時會吸收大量水分及水中的無機鹽。不同生活環境中不同的礦質元素含量及比例可以使蟹背甲在生長過程中發生細微變化。中華絨螯蟹相關深層次機制性的原因仍需今后開展精準且有針對性的試驗來論證。

本研究中雌、雄蟹的背甲形態之間也存在細微差異。Rufino等[30]對梭子蟹(Liocarcinusdepurator)的研究也發現,雄性和雌性之間的背甲形態有明顯的差異,雌蟹的腹部底部較長,也更凹,而雄蟹背甲較寬;Snchez等[31]的研究也表明,同種生物的不同種群在不同性別之間會因生存環境的不同而產生形態上的變化。在區分蟹性別研究的基礎上,將單個產地雌、雄蟹作為整體,進行不區分性別的產地判別,結果顯示存在一定程度的誤判,判別準確率為98.4%,低于區分性別時100%的判別結果,雖然判別結果仍然具有較好的區分度,但是從散點圖可以發現,性別的差異對產地的差異產生了極大的影響,各產地樣本的分散程度大,出現了較多的重疊現象,散點圖中的區分度低于區分性別時的結果。因此,在進行不同產地之間中華絨螯蟹背甲幾何形態分析時,宜將蟹性別區分開進行研究。這也說明中華絨螯蟹在生長過程中,其背甲會因性別不同和生存地理環境的不同產生形態的差異,并形成與其棲息地相適應的變化。因此,在進行不同產地之間中華絨螯蟹背甲幾何形態分析時,宜將蟹區分性別來進行研究,才能獲得合理的效果。這也說明中華絨螯蟹在生長過程中,其背甲形成與其棲息地相適應的變化還會受到性別的影響,并很可能產生背甲形態的性二型現象。中華絨螯蟹背甲形態的這些特征性變化為基于地標點的幾何形態測量學的發展提供了潛在價值,為不同產地中華絨螯蟹形態品質的評價提供了重要理論依據。

3.2 中華絨螯蟹背甲的幾何形態測量學產地判別的實用性

傳統的形態測量方法(如框架法等)往往不適用于淡水蟹類的鑒定[32],因為它們的外部形態變化無常。在軟體動物的研究中,蘇杭[33]通過不同形態學測量方法對柔魚(Ommastrephidebartramii)和莖柔魚(Dosidicusgigas)的群體鑒別和差異性進行分析,研究發現,相對于傳統測量學法,幾何形態測量學中地標點法具有更好的判別效果;在魚類的研究中,Ponton[34]也比較了傳統測量法、地標點幾何形態測量法等區分印度小公魚(Stolephorusindicus)、戴氏半棱鳀(Encrasicholinadevisi)、尖吻半稜鳀(E.heteroloba)、刺公鳀(E.punctifer)等4種魚耳石的有效性,其結果同樣表明,地標點幾何形態測量法比傳統測量法和其他方法更加有效,并且能夠可視化地表達出耳石隨著生長形態變異的趨向。作為相關產地初步的探索,由于受到所采樣本數的限制,來自江蘇石臼湖的雄蟹僅有2只,今后需要采集更多的個體來開展更深入的研究。

筆者選取的雌、雄中華絨螯蟹背甲地標點的切空間距離和普氏距離的回歸系數分別為0.999 808和0.999 838,均接近于1,這說明選取的地標點是有效的,且雌、雄蟹背甲判別準確率均為100%。但在姜曉東等[15]關于幾何形態測量學區分不同水系野生中華絨螯蟹的研究中,各群體中華絨螯蟹的平均判別準確率僅為87.67%,其選取的地標點個數為30個,包含22個Ⅲ型地標點,7個Ⅱ型地標點;而筆者選取了35個地標點,包含33個Ⅱ型地標點,2個Ⅲ型地標點,且貢獻率高的均為Ⅱ型地標點(第11、12、16、17地標點),產地判別準確率也均高達100%。Zheng等[18]關于長江水系部分湖泊、黃河水系的東營地區以及遼河水系的營口和盤錦地區的中華絨螯蟹背甲幾何形態的研究結果也表明,以Ⅱ型為主的地標點,其產地區分成功率高達100%。這說明對于中華絨螯蟹背甲幾何形態研究方面,地標點選取Ⅱ型為宜。此外,地標點的數量不宜過少,避免造成信息的缺失;也不宜過多,避免多余貢獻率低的坐標點,增大試驗誤差。因此,對不同水生生物開展基于地標點的幾何形態測量學法的研究時不能一概而論,要特別關注其形態的物種特點和相應地標點類型的組成特征來進行。

綜上所述,基于地標點法的幾何形態測量學在中華絨螯蟹產地判別的實用性方面潛力顯著且切實可行。相較于通過穩定同位素等分析法[35]判別蟹類產地差異性而言,地標點的幾何形態測量學方法有效地解決了需要致死蟹才能進行試驗的問題。且該方法還具有成本低、耗時少、結果準確性高的優勢。因此,基于地標點的幾何形態測量法可為中華絨螯蟹等生物的產地辨別、原產地溯源及保護工作提供更便捷有效方法和非致死的創新途徑。

迄今,通過相同的基于地標點法的幾何形態測量學方法,本實驗室已對諸多產地的中華絨螯蟹進行了背甲形態差異的鑒別[6-7],同時也對陽澄湖“洗澡”蟹與原產蟹背甲形態進行了成功的鑒別[7]。本研究結果又進一步拓展了該法的應用及其相關的數據庫,擴充到了更多省份及湖區產地的絨螯蟹,也進一步證實了該方法在同一水系精細尺度產地間中華絨螯蟹相應形態差異判別的可行性。

當前,中華絨螯蟹產業已成為鄉村振興中堅持生態優先和綠色發展,用技術創新提升特色產業品質的重要抓手。近些年江蘇陽澄湖等地區已建立了中華絨螯蟹的原產地保護、地理標識等高質量發展的制度[36]。在今后的研究中,還需強化幾何形態測量學相關技術的研究,擴展其在判別知名產區來源高質中華絨螯蟹的可靠性等領域的應用,并注重所獲判別方法及其產地溯源可行性的再確認工作,以便以新角度為上述制度的有效執行做出貢獻,也可為中華絨螯蟹產業鄉村振興、特色強農戰略提供理論和技術支持。

4 結 論

長江中下游7個產地的中華絨螯蟹背甲形態存在明顯的差異。基于背甲地標點的幾何形態測量學法對產地間雌、雄蟹個體的判別準確率均可達100%。背甲幾何形態測量學法可為精細尺度產區中華絨螯蟹原產地溯源提供更為便捷且非致死的技術途徑。