紫鉚因通過調(diào)控miR-487a-3p表達抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲的機制

李彬 阮劍 袁媛 寧曉潔 趙建國

(武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院 武漢市第一醫(yī)院甲乳外科,湖北 武漢 430022)

乳腺癌是一種臨床常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率較高,尋找副作用少的新藥是當下抗腫瘤藥物領域研究的重點,中藥具有多成分多靶點的特點,是治療乳腺癌的重要手段〔1,2〕。紫鉚因又名紫鉚查爾酮,是一種從漆樹中分離出來的植物多酚類物質,作為傳統(tǒng)中草藥具有多種藥理活性,如抗氧化、抗腫瘤〔3〕。報道顯示,紫鉚因可以抑制宮頸癌細胞Hela的增殖,促進其凋亡〔4〕。紫鉚因可以通過抑制PI3K-Akt信號通路促進U2OS骨肉瘤的凋亡并抑制其侵襲轉移〔5〕。紫鉚因可通過減少細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生來抑制乳腺癌的生長〔6〕。紫鉚因可抑制三陰性乳腺癌細胞增殖〔7〕。然而紫鉚因對乳腺癌細胞的影響及其潛在的分子機制及作用靶點仍需進一步的研究驗證。研究報道m(xù)iR-487a-3p在胰腺癌〔8〕和前列腺癌〔9〕組織中低表達,過表達miR-487a-3p可抑制胰腺癌、前列腺癌細胞增殖和遷移。然而miR-487a-3p對乳腺癌細胞生物學行為的影響及紫鉚因之間的聯(lián)系仍未可知。本實驗重點考察紫鉚因在乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲和miR-487a-3p表達中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1臨床資料 采集武漢市第一醫(yī)院2018年1月至2020年12月乳腺癌患者(43例)的癌組織及癌旁組織(距離癌組織邊緣5 cm),年齡29～78歲,平均(52.7±2.1)歲;經(jīng)手術切除癌組織,患者均知情且同意。本研究患者或家屬均簽署知情同意書并由醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2細胞與主要試劑 MDA-MB-231細胞(美國ATCC);紫鉚因(純度≥98%,無錫云萃生物科技有限公司);甲基噻唑藍(MTT)細胞增殖檢測試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司);放射免疫沉淀分析法(RIPA)蛋白裂解液、結晶紫(北京百奧萊博公司);RNA提取及熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。

1.3細胞分組與處理 RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)MDA-MB-231細胞并將細胞分為對照組(正常培養(yǎng))、紫鉚因-低、中、高組(給予10、20、40 μmol/L的紫鉚因處理48 h)、miR-NC組(將miR-NC轉染至MDA-MB-231細胞)、miR-487a-3p組(將miR-487a-3p模擬物轉染至MDA-MB-231細胞)及紫鉚因+anti-miR-NC組(將miR-487a-3p抑制劑的陰性對照轉染至MDA-MB-231細胞后,用40 μmol/L的紫鉚因處理48 h)、紫鉚因+anti-miR-487a-3p組(將miR-487a-3p抑制劑轉染至MDA-MB-231細胞后,用40 μmol/L的紫鉚因處理48 h)。

1.4細胞增殖活性檢測 在96孔板上接種各組MDA-MB-231細胞(每孔5 000個細胞,含100 μl培養(yǎng)基),孵育48 h,加入MTT試劑(20 μl/孔),再孵育4 h;然后棄去培養(yǎng)基,加入二甲基亞砜(150 μl/孔)使晶體完全溶解,10 min內(nèi)用酶標儀測量每孔的吸光度(OD)值,檢測波長570 nm,計算細胞增殖抑制率(%)。

1.5克隆形成實驗 在6孔板中培養(yǎng)各組MDA-MB-231細胞(1 000個/孔),生長2 w形成集落后,用4%多聚甲醛固定15 min,并用0.1%結晶紫染色30 min,觀察并計數(shù)>50個細胞的克隆數(shù)。

1.6劃痕愈合實驗 各組MDA-MB-231細胞接種于6孔板中,培養(yǎng)過夜細胞鋪滿孔底后,用無菌移液管尖端在細胞單層上劃一條線,然后更換培養(yǎng)基進一步培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)0 h和48 h時對劃痕進行拍照并用Image-Pro Plus6.0軟件對劃痕寬度進行量化,計算劃痕愈合率。

1.7Transwell小室實驗 將1×104個細胞在無血清培養(yǎng)基中重懸,取100 μl細胞懸液接種到Transwell上室(有基質膠包被),600 μl完全培養(yǎng)基加入下室。孵育24 h后去除上表面剩余細胞,侵入的細胞用4%多聚甲醛固定,0.1%結晶紫染色。顯微鏡下計算5個視野的侵襲細胞數(shù)。

1.8Western印跡法檢測MMP-2、MMP-9蛋白表達 用RIPA裂解緩沖液提取各組細胞總蛋白,50 μg蛋白樣品用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉膜,然后用5%脫脂奶粉封閉膜1 h;將膜與一抗基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)4 ℃孵育過夜,與二抗在室溫下反應1 h,增強化學發(fā)光試劑使條帶可視化,分析條帶灰度值,計算目的蛋白相對表達量。

1.9RT-qPCR分析miR-487a-3p表達 使用Trizol試劑提取組織/細胞總RNA,使用miRcute miRNA-cDNA Kit通過逆轉錄反應合成單鏈互補DNA(cDNA),然后在實時PCR儀上擴增miRNA,采用2-ΔΔCt法分析miR-487a-3p相對表達量,U6為內(nèi)參。

1.10統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1紫鉚因抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖 與對照組比較,紫鉚因-低、中、高組細胞增殖抑制率顯著升高,克隆形成數(shù)顯著減少,呈顯著濃度依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞增殖、遷移、侵襲能力及miR-487a-3p水平比較

2.2紫鉚因對miR-487a-3p表達的影響 與對照組比,紫鉚因低、中、高組miR-487a-3p水平顯著升高,呈顯著濃度依賴性(P<0.05)。見表1。

2.3紫鉚因對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移、侵襲的影響 與對照組比,紫鉚因-低、中、高組劃痕愈合率、侵襲細胞數(shù)和MMP-2、MMP-9蛋白水平顯著降低,呈顯著濃度依賴性(P<0.05)。見圖1、圖2、表2。

1～8:對照組、紫鉚因-低組、紫鉚因-中組、紫鉚因-高組、miR-NC組、miR-487a-3p組、紫鉚因+anti-miR-NC組、紫鉚因+anti-miR-487a-3p組;圖2同圖1 紫鉚因對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移、侵襲相關蛋白表達的影響

表2 miR-487a-3p過表達抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲

2.4miR-487a-3p在乳腺癌組織中的表達 乳腺癌組織中miR-487a-3p的表達水平顯著低于癌旁組織(0.37±0.04 vs 1.00±0.10,n=43,t=30.373,P<0.05)。

2.5miR-487a-3p過表達抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲 與miR-NC組比,miR-487a-3p組miR-487a-3p水平、增殖抑制率顯著升高,克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲細胞數(shù)和MMP-2、MMP-9蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見圖1、圖2、表2。

2.6抑制miR-487a-3p表達逆轉了紫鉚因對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移侵襲的影響 紫鉚因+anti-miR-487a-3p組相較于紫鉚因+anti-miR-NC組,miR-487a-3p水平、細胞增殖抑制率顯著降低,克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲細胞數(shù)和MMP-2、MMP-9蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖1、圖2、表3。

表3 抑制miR-487a-3p表達逆轉了紫鉚因對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲的作用

3 討 論

在乳腺癌治療中,中醫(yī)藥是重要手段之一,其可多層次、多途徑抑制腫瘤,且毒副作用小,闡明中醫(yī)藥的具體作用機制,可以更好地發(fā)揮其效用〔10〕。紫鉚因作為一種傳統(tǒng)中藥,具有抗腫瘤作用,如紫鉚因可通過抑制磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路的活化抑制人胃癌細胞增殖〔11〕。紫鉚因可抑制人胰腺癌細胞增殖和促進細胞凋亡〔12〕。紫鉚因可通過下調(diào)雌激素受體(ER)α抑制乳腺癌生長〔13〕。以上研究表明紫鉚因對多種腫瘤均具有抗癌作用。本實驗結果發(fā)現(xiàn)紫鉚因可濃度依賴性地抑制MDA-MB-231細胞增殖、遷移侵襲,提示紫鉚因具有抗對乳腺癌生長的作用。

miR-487a-3p屬于miRNA的一種,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程;研究報道m(xù)iR-487a-3p通過靶向PPM1A抑制口腔鱗狀細胞癌的生長和侵襲〔14〕。miR-487a-3p可通過抑制TM4SF1的表達抑制腎癌細胞ACHN的增殖和侵襲〔15〕。本實驗結果顯示,乳腺癌組織中miR-487a-3p的表達水平顯著低于癌旁組織,過表達miR-487a-3p可降低MDA-MB-231細胞的增殖、遷移和侵襲能力,并降低MMP-2、MMP-9表達;表明過表達miR-487a-3p可抑制MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲,提示miR-487a-3p可能在乳腺癌中起抑癌作用。此外,本實驗發(fā)現(xiàn)紫鉚因可上調(diào)miR-487a-3p表達,敲低miR-487a-3p可明顯減弱紫鉚因對MDA-MB-231細胞惡性行為的抑制作用。

總之,紫鉚因可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移和侵襲,其作用機制可能與上調(diào)miR-487a-3p表達有關。