透明質酸的抑菌性能及在干酪制品中的應用

柴云雷 郭 麗 張雅娜 郭 齊

（綏化學院食品與制藥工程學院 黑龍江綏化 152061）

透明質酸（hyaluronic acid，HA）是一種大分子線性黏多糖，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基氨基-D-葡萄糖二糖單位交替連接組成，它廣泛存在于高等動物的各種組織中，不同組織中含量不同，其中眼玻璃體、皮膚、臍帶和關節滑液中含量較高[1]。HA為大分子物質，其相對分子量（relative molecular mass，Mr）大約為5～20000 kDa，因其分子中含有大量羥基和羧基，所以具有極強的保水作用[2]。此外HA還具有良好的抗炎促修復、調控細胞增殖、分化和遷移等作用。不同生物體，不同組織來源的HA其分子量大小不同，發揮作用也不同[3]。研究表明，高Mr的HA能夠刺激抗炎癥反應，抑制細胞增殖、分化和遷移，抑制血管和顆粒組織生成。反之，低Mr 的HA 會增強促炎癥基因的表達，誘導細胞增殖，促進血管生成[4-6]。目前關于HA的研究還主要集中在醫學和化妝品方面，而其它方面的性能還有待進一步研究。

干酪（又稱奶酪）是指在乳中（也可以是脫脂乳或稀奶油）中加入適量發酵劑和凝乳酶使乳蛋白質凝固，排除乳清后，將凝塊壓成所需性狀而制成的產品[7]。干酪可以說是純奶的濃縮，因而含有的營養物質更加豐富，極易被微生物污染發生變質，所以一般通過添加食品防腐劑來延長食品保質期。考慮到化學合成類添加劑的安全隱患，近年來研究者更多將目光投向天然提取類物質，如，在奶酪制品中添加納他霉素。有報道稱HA具有抑菌性[8]，但其抑菌性的研究主要集中在與其他物質的結合方面，如，Jayesh 等[9]在將HA 與頭孢西丁鈉復合研究抑菌性，Sara 等[10]在將HA 與殼聚糖復合研究其抑菌功效等。而單獨研究HA抑菌性的幾乎沒有，再結合HA的性能與相對分子量和濃度相關這一特點，因此，本文將不同Mr 不同濃度的HA 進行抑菌性能的比較研究，并將HA應用于干酪制品中測定其抑菌效果，該研究對進一步了解、開發和應用透明質酸提供了一定的理論依據，同時為天然型防腐劑的選擇打開新思路。

一、材料和方法

（一）材料和試劑。高Mr（1800-2200 kDa）、中Mr（1300-1500 kDa、800-1000 kDa）和低Mr（200-400 kDa）的透明質酸粉末[11]：山東福瑞達生物醫藥有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和志賀氏菌（Shigella）：綏化市食品藥品檢驗檢測所；啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：百威英博哈爾濱啤酒有限公司；馬鈴薯、妙可藍多馬蘇里拉干酪（原制干酪）、妙可藍多奶酪棒（再制干酪）：市售。

牛肉膏：北京路橋技術有限責任公司；蛋白胨、瓊脂粉：北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖、氯化鈉：天津市天力化學試劑有限公司；平板計數瓊脂培養基（PCA）：青島高科技工業園海博生物技術有限公司。以上試劑均為分析純。

（二）儀器和設備。XFH-30L高壓蒸汽滅菌鍋：浙江新豐醫療器械有限公司；DHP-9162電熱恒溫培養箱：上海-恒科學儀器有限公司；XH-C旋渦混合器：金壇市白塔新寶儀器廠：752紫外-可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司。

（三）透明質酸抑菌性能的比較。

1.透明質酸抑菌作用的測定。

（1）培養基的配制。馬鈴薯葡萄糖培養基：將馬鈴薯去皮切成小塊，稱取200 g放入鍋中，加1000 mL蒸餾水，在電爐上加熱至沸騰，維持25 min后，趁熱用2層紗布過濾，棄去濾渣，在濾液中加入20 g葡萄糖溶解后，加蒸餾水補至1000 mL，固體培養基另加20 g瓊脂粉，pH自然，放入高壓蒸汽滅菌鍋，121℃滅菌15 min，用于培養啤酒酵母。牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，加入蒸餾水溶解定容至1000 mL，固體培養基另加20 g瓊脂粉，調pH 7.0～7.2，121℃滅菌15 min，用于培養大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌。

（2）菌種純化及菌懸液的制備。從-80℃冰箱中取出各菌種放在4℃冰箱中備用，在無菌操作環境下，用接種環蘸取一環菌種，在固體平板培養基上劃線，倒置于培養箱中培養。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌劃線在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基上，37℃培養24 h，啤酒酵母劃線在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，28℃培養48 h。然后分別挑取單菌落接種于相應液體培養基中，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌37℃培養18 h，啤酒酵母28℃培養24 h。最后用接種環蘸取菌液劃線于相應的試管斜面，培養后放入4℃冰箱備用。

使用前，在無菌條件下挑取一環接種于5 mL無菌生理鹽水中，渦旋混勻后制成菌懸液。

（3）濾紙片法測定透明質酸的抑菌作用。稱取不同質量（0.015 g、0.010 g、0.005 g）HA粉末溶解于10 mL無菌水中，放置在4℃冰箱中溶解分別制備成濃度為15 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL的溶液。吸取100 μL的菌懸液接種到相應固態培養基中，用涂布棒涂布均勻。將濾紙用打孔器制成直徑6 mm的濾紙片若干，放入培養皿中高壓滅菌，干燥器中干燥后，分別放入不同濃度的HA 溶液中浸泡20 min，瀝干后用鑷子均勻鋪在培養基上[12]。每個培養基中放入5 個濾紙片。其中1、2、3 號用同一HA溶液浸泡作為平行試驗，4號用75%乙醇浸泡為陽性對照，5號用無菌水浸泡為陰性對照。處理好的培養皿倒置于培養箱中，細菌在37℃培養24 h，真菌在28℃培養36 h，培養后用游標卡尺量取抑菌圈直徑（mm），結果取平均值。

2.透明質酸最小抑菌濃度的測定。采用試管二倍稀釋法將不同Mr 的HA 分別配制成濃度為10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078、0.039、0.019、0.009 mg/mL 的溶液，依次取5 mL各濃度HA溶液于11支無菌試管中，再各加入0.5 mL菌懸液和5 mL 對應的無菌液體培養基[13]。0 號陰性對照管中加入5.5 mL無菌水和5 mL對應的液體培養基，12號陽性對照管中加入5 mL無菌水、5 mL對應的液體培養基和0.5 mL菌懸液。

將處理后的樣品分別放入各菌種培養條件下培養24～36 h。結束后觀察試管渾濁情況并在600 nm波長下測定此時溶液的吸光度值。若液體澄清且吸光度值接近陰性對照，此時對應的HA溶液最小濃度即為MIC值。

（四）透明質酸在干酪制品中的抑菌作用。取700 g干酪制品，均分成14份且形狀為見方形，標號為1～14號。其中1～7號樣品作為對照組不添加HA。8～14號樣品作為試驗組，均在干酪制品表面涂抹1.5 mL高Mr、濃度為10 mg/mL的HA溶液。將制備好的樣品用滅菌的玻璃廣口瓶密封包裝，室溫存放。然后分別在放置的第1、2、3、4、5、6、7 d從對照組和試驗組中各取1個樣品進行菌落總數的測定，測定方法依據國家標準GB 4789.2-2016中的平板計數法[14]。

（五）數據處理。試驗均重復3次，結果表示為“平均值±標準偏差（Means±SD）”，采用OriginPro 8.5.1 軟件進行繪圖，SPSS Statistics 20.0 軟件進行單因素ANOVA 分析和Tukey 多重比較分析，P＜0.05表示差異顯著。

二、結果與分析

（一）透明質酸抑菌作用的試驗結果。中Mr（1300-1500 kDa）、濃度為15 mg/mL的HA溶液，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母和志賀氏菌的抑菌效果見圖1。

圖1 中相對分子量HA對不同菌種抑菌圈效果圖

為直觀清晰比較不同Mr、不同濃度的HA溶液對四種供試菌的抑菌作用，將抑菌結果制成表1～表4。

表1 高Mr（1800-2200kDa）透明質酸抑菌試驗結果比較

表2 中Mr（1300-1500 kDa）透明質酸抑菌試驗結果比較

表3 中Mr（800-1000 kDa）透明質酸抑菌試驗結果比較

表4 低Mr（200-400 kDa）透明質酸抑菌試驗結果比較

由表1可知，對照組無菌水抑菌圈直徑為6mm，且對不同菌株之間無顯著性差異，說明試驗結果有效可行。高Mr（1800-2200 kDa）的HA不同濃度的抑菌圈直徑均大于6 mm，說明HA具有抑菌性。這與鐘良軍發現結果相符，陳菲等[15]在研究HA與鹽酸米諾環素聯合抑菌時，發現單獨HA也具有抑菌作用，這也與本研究結果一致。抑菌圈直徑在不同濃度和不同菌種之間的ANOVA 分析中均有顯著性差異，說明其抑菌效果與之相關。同一菌種不同濃度的HA 其抑菌性表現為：10%＞5%＞15%，且抑菌性均大于75%乙醇。HA隨分子量增大，分子體積也增大，因其強大的吸水性，使體積增大速率會更快，是分子量增大的1.8倍，使溶液粘度增加，而有限的空間HA鏈擁擠在一起，使其不利于與微生物接觸并起到抑制作用[16]。同樣溶液濃度增大也會使溶液粘度增大，大分子聚集，不利于抑制微生物生長。所以高Mr 的HA 在高濃度時抑菌性降低。而在低濃度時，雖然HA分子量較大，但仍可以單體狀態存在，與微生物較好的接觸并抑制其生長。同一濃度HA對不同菌種的抑菌性表現為：大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞啤酒酵母＞志賀氏菌，Ardizzoni等[17]在研究HA抑菌能力時，證明了HA對不同微生物菌屬有不同的抑菌能力，這與本試驗結果一致。但由于試驗菌種較少，不能判斷HA的抑菌規律，可通過后續擴大菌種范圍進一步研究。

由表2和表3可知，中Mr的HA具有抑菌性，且抑菌性仍大于75%乙醇。同一菌種不同濃度HA 的抑菌性表現為：15%＞10%＞5%，因為HA分子量下降，體積減少，溶液粘度降低使其能在溶液中較好的分散，即使在較高濃度下仍能以單體狀態存在并發揮抑菌作用。但中Mr（1300-1500 kDa）的HA（15%濃度）其抑菌性略低于高Mr的HA（10%濃度），可在后續將中Mr的HA溶液濃度提高做進一步研究。綜合表1，表2，表3可知，HA 隨Mr 下降其抑菌性能降低。在差異性比較中也發現，HA隨Mr下降，不同濃度間抑菌圈直徑的差異性降低，且與75%乙醇的抑菌性差距縮小。同一濃度HA溶液對不同菌種的抑菌性仍表現為：大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞啤酒酵母＞志賀氏菌。

由表4可知，低Mr的HA同樣具有抑菌性，但這與沙坤等認為的HA 的低Mr 與高Mr 在性能方面相反的這一說法不同，原因是目前對于低Mr的HA定義還很模糊，在不同研究中HA分子量從少量雙糖到700 kDa均有用“短片段HA”、“低分子量”和“HA 寡糖”來進行描述，因此對于低Mr 的HA 在性能上會存在差異。但由表4可知，低Mr的HA抑菌性能明顯降低，這與之前分析的分子量下降抑菌性能降低結果一致。不同濃度的HA其抑菌性同樣表現為：15%＞10%＞5%，且10%的抑菌性能與75%乙醇相近，5%的抑菌性能低于75%乙醇。HA對不同菌種的抑菌性表現為：大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞啤酒酵母＞志賀氏菌。

（二）透明質酸MIC測定試驗結果。不同Mr的HA對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母和志賀氏菌的MIC 結果見表5～表8。

表5 高Mr（1800-2200 kDa）MIC測定結果

表6 中Mr（1300-1500 kDa）MIC測定結果

表7 中Mr（800-1000 kDa）MIC測定結果

表8 低Mr（200-400 kDa）MIC測定結果

由表5 可知，高Mr 的HA 在0.009～0.039 mg/mL 的濃度范圍，對四種供試菌均無抑制性。HA對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母和志賀氏菌的MIC 值依次為：0.312、1.25、2.5 和2.5 mg/mL，再結合不同濃度下菌種的生長情況可知對四種菌的抑菌情況為：大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞啤酒酵母＞志賀氏菌，與抑菌圈測定結果一致。

由表6可知，HA在0.009～0.078 mg/mL的濃度范圍，對四種供試菌均無抑制性，MIC 值依次為：1.25、2.5、2.5 和2.5 mg/mL。由表7可知，HA在0.009～0.156 mg/mL的濃度范圍，對四種供試菌均無抑制性，MIC值依次為：2.5、2.5、2.5和5 mg/mL，這些數據都進一步說明隨Mr 降低HA 的抑菌性呈下降趨勢。同樣與抑菌圈測定結果相符。

由表8可知，低Mr的HA在0.009～0.156 mg/mL的濃度范圍內，對四種供試菌無抑制性，但濃度在0.312 mg/mL時其抑菌性低于中Mr的HA，其MIC值僅對大腸桿菌達到2.5 mg/mL，對其余三種菌株均為5 mg/mL，結合表4結果發現HA濃度為5 mg/mL時抑菌圈直徑大小都為6 mm附近，說明雖然有抑菌效果，但抑菌效果很小，前后結果相符。

（三）透明質酸在干酪制品中的抑菌作用。經上述研究發現，高Mr的HA在10 mg/mL時抑菌作用最強，將其應用于原制干酪和再制干酪兩款產品，測定樣品存放期間菌落總數的變化，結果見表9和圖2。

表9 不同干酪制品在存放期間菌落總數的變化

由圖2可知，干酪制品在存放期間其菌落總數隨時間延長呈上升趨勢。相比于干酪制品對照組，試驗組在添加HA后明顯抑制了樣品中菌落總數的生長。對照組樣品在第7天菌落總數達到105 cfu/mL，而試驗組的菌落總數為104 cfu/mL。對照組在前3天菌落總數增加較為緩慢，這是因為在干酪制品中本身存在食品防腐劑，其中原制干酪中添加了山梨酸鉀和納他霉素，再制干酪僅添加山梨酸鉀，因為原制干酪營養較再制干酪更為豐富，所以更易變質。試驗組中因為添加HA，使樣品的菌落總數在第4天之后開始快速增長，延長了微生物生長的遲緩期，這與食品防腐劑作用相同。之后對照組和試驗組中菌落總數均開始快速增長，是因為食品防腐劑僅能起到抑制微生物生長，延長遲緩期的作用，而當樣品中微生物達到一定數量時，即使添加再多防腐劑也無用。在第6天之后，樣品中的菌落總數增長速率有所下降，是因為食品中營養物質的下降，以及微生物間的競爭作用。

三、結語

本研究通過比較高Mr（1800-2200 kDa）、中Mr（1300-1500 kDa、800-1000 kDa）、低Mr（200-400 kDa）四種HA 在不同濃度（15 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL）時對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母和志賀氏菌的抑菌性能，發現不同Mr、不同濃度的HA 對四種供試菌均具有抑菌性，且抑菌性能隨HA 的Mr 降低而呈下降趨勢。高Mr 的HA 在中濃度（10 mg/mL）時抑菌性能最高，中Mr 和低Mr 的HA 在高濃度（15 mg/mL）時抑菌性能較高。HA 對四種供試菌的抑制程度依次為：大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞啤酒酵母＞志賀氏菌。將HA應用于干酪制品，發現樣品在存放期間菌落總數的增長得到明顯抑制，具有食品防腐劑功效，該研究為HA的應用開發奠定了一定理論基礎。