羧肽酶A4調控三陰性乳腺癌干性及上皮-間質轉換的機制*

李映東 王鐵延 歐琴 章書銘 李文仿

(湖北醫藥學院附屬太和醫院1.乳腺甲狀腺中心;2.病理科,湖北 十堰 442000)

乳腺癌被分為luminal A,luminal B,人表皮生長因子受體2(HER-2)和三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)等不同分子亞型[1]。TNBC以ER、PgR、HER2的缺失為特征,表現出相對的侵襲性表型,治療抵抗和預后不良特征。TNBC富含癌干細胞(Cancer Stem Cells,CSCs)和上皮-間充質細胞轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)特征,特征是上皮標志物的下調和出現具有間充質表型的高侵襲、遷移能力[2]。羧肽酶A4(CPA4)催化釋放羧基端氨基酸,其過表達有與肝癌、肺癌的等癌癥發展有關[3]。最近研究表明CPA4與p53表達呈負相關,抑制CPA4可減少具有干細胞特征的乳腺癌細胞數量,可能是TNBC治療的一個潛在靶點[4]。然而,很少有研究探討CPA4在TNBC患者的表達及臨床病理因素關系。本研究的目的是闡明TNBC中CPA4表達與干性及EMT的關系,為此進行免疫組化評估TNBC中CPA4表達與臨床病理標志物,包括干性蛋白醛脫氫酶1(ALDH1)、NANOG,EMT相關蛋白e-鈣粘蛋白(E-cadherin)、Vimentin、EGFR等表達關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2019年1月-2021年10月手術切除經臨床病理診斷確診的TNBC早期患者168例,同期非TNBC共40例,同期乳腺包塊切除后診斷乳腺增生組織20例。其中年齡29～73歲,平均(52.28±4.12)歲,腫瘤<2 cm者53例,腫瘤≥2 cm者115例,年齡≤50歲共107例,年齡>50共61例。納入標準:①患者經穿刺病理活檢確診為乳腺癌。②患者病理標本檢測均顯示ER、PgR及HER-2表達陰性。③男性乳腺癌除外。④患者入院前未接受任何形式的手術治療、放療或化療。⑤所有患者確診時均經肺部及顱腦CT、骨掃描、肝膽B超等排除遠處轉移。排除標準:①合并存在其他嚴重器質性病變或臟器功能不足。②合并存在其他惡性腫瘤。③精神疾病患者,無法有效配合研究的開展。腫瘤大小、淋巴結轉移、組織學分級情況,是否新輔助化療等情況根據病理資料及患者病歷記載資料。

1.2 設備與試劑 采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(Streptavidin-perosidase,SP)法檢測相對蛋白表達。CPA4(貨號:RMA-0807)、EGFR抗體(貨號:RMA-0804)均購自福州邁新生物技術開發有限公司,E-cadherin(貨號:ab1416)抗體購自Abcam公司,ALDH1A1(貨號:54135S)、NANOG(貨號:4903S)、Vimentin(貨號:46173SF)購自Cell Signal公司。SP試劑盒及二氨基聯苯胺(Diaminobenzidine,DAB)試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色方法 采集患者腫瘤組織部位標本,應用10%甲醛溶液進行石蠟包埋處理后連續切片。對切片標本進行脫蠟水化處理和微波修復抗原處理,參照諾丁漢聯合組織學分級標準[5],將TNBC分為1、2、3級[6]。

1.3.2 免疫組化染色結果判讀 石蠟切片厚4 μL,切片二甲苯脫蠟,枸櫞酸鈉溶液抗原修復液98 ℃持續15 min修復抗原,兔抗人CPA4單克隆抗體(1∶100)4 ℃過夜,切片用PBS沖洗,與辣根過氧化酶標記的二抗孵育,DAB檢測,蘇木素染色,最后由兩名專業病理學家進行評估。記錄染色強度為陰性至強(0～3),陰性(0分),弱陽性(1分),中等陽性(2分),強陽性(3分)。染色陽性面積評分0分(<10%);1分(10%～25%);2分(26%～50%);3分(51%～75%);4分(>76%)。染色面積評分×染色強度評分為最終得分,得分≥4判斷陽性,<4判斷陰性[7]。NANOG,E-cadherin,Vimentin參考CPA4染色方法判斷[7]。ALDH1主要定位于細胞漿,染色細胞總數>10%判斷陽性[8]。EGFR腫瘤細胞胞質或胞膜著色即判為陽性(+),否則判為陰性(-)[5]。

1.4 si-CPA4轉染 設空白對照組、無效干擾組及si-CPA4組。設計小分子靶向CPA4的核苷酸序列siRNA:5′-GCAGCACGGC AGTCTTTGAGT-3′,序列由上海生工合成,無效干擾RNA為不靶向作用任何mRNA的小分子核苷酸序列(siRNA NC),序列為:5′-UUCUCCGAACGU GUCACGU-3′。CPA4的siRNA按照轉染Lipofection 200說明,轉染乳腺癌細胞MDA-MB-231。

1.5 MTT細胞增殖實驗 MDA-MB-231細胞在96孔板上,實驗分為空白對照組,無效干擾組及si-CPA4組,轉染24 h后每孔6.0×103細胞在37 ℃,5% CO2條件下培養在10%胎牛血清的DMEM中。用無菌3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)20 μL(5mg/ml;Sigma, USA),在37 ℃下放置4 h,然后去除培養基,加入150 μL的二甲亞砜(DMSO),充分混合10 min,測量490 nm處的光譜吸光度。每組在每個時間點設3個重復孔,實驗獨立重復3次。用490 nm處的吸光度隨時間變化繪制了生長曲線。

1.6 細胞克隆形成 乳腺癌細胞系MDA-MB-231培養在6孔板,按最終濃度為100 nM的CPA4組或siRNA NC組及空白對照組,轉染24 h后,96孔板每孔接種1000個細胞,連續培養10 d,結晶紫染色,計算克隆數。

1.7 細胞成球實驗 實驗分為空白對照組、無效干擾組及si-CPA4組,轉染24 h后以2000細胞/孔種植24孔板,用含B27(A1895601,Thermo Fisher Scientific),20 ng/mL EGFR (PV4289,Thermo Fisher Scientific),20 ng/mL FGF (PHG 6015,Thermo Fisher Scientific)的DMEM/F12培養10 d,計數細胞成球數目。

1.8 細胞劃痕實驗 實驗分為空白對照組、無效干擾組及CPA4組。將MDA-MB-231細胞無血清培養24 h,在6孔板中每孔鋪1×106個細胞。按照轉染Lipofection 2000說明,轉染乳腺癌細胞MDA-MB-231,48 h后用10 μL無菌槍頭劃痕,24 h后觀察細胞遷移,計算每組細胞遷移距離。

1.9 細胞侵襲實驗 將MDA-MB-231細胞無血清培養24 h,實驗分為空白對照組、無效干擾組及si-CPA4組。轉染乳腺癌細胞,48 h后用Matrigel涂布8 mm孔的Transwell小室,將5×105個細胞鋪到細胞小室中,在下面的孔板上加入含有10% FBS的培養基,在24 h后用棉簽將沒有侵襲的細胞輕輕刮走,4%多聚甲醛固定,結晶紫染色,對染色的細胞進行統計分析。

1.10 蛋白質印跡法檢測ALDH1A1、NANOG、E-cadherin、Vimentin蛋白 利用RIPA裂解液獲得MDA-MB-231細胞的蛋白,吸取50 μg蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,將其轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,經5%脫脂牛奶封閉1 h。4 ℃加入CPA4、ALDH1A1、NANOG、E-cadherin、Vimentin蛋白抗體(均為1∶1 000 稀釋)孵育,次日加入二抗孵育2 h,顯影,以GAPDH為內參,分析蛋白條帶灰度值。

1.11 統計學分析 采用SPSS 17軟件進行統計學分析,乳腺癌及乳腺增生組織中CPA4表達差異采用四格表χ2檢驗,CPA4表達與乳腺癌臨床病理特征關系采用四格表χ2檢驗。MDA-MB-231細胞克隆形成,細胞成球及侵襲、遷移實驗結果采用t檢驗,P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TNBC中CPA4表達臨床特點 CPA4陽性表達表現為在細胞膜中見棕黃色顆粒,168例TNBC患者中CPA4陽性表達率為57.14%(96/168),見圖1A、B。非TNBC乳腺癌組織中表達陽性率為37.5%(15/40),而在乳腺增生組織中表達陽性率為20%(4/20),見圖1C、D。TNBC組織中CPA4表達明顯高于非TNBC,差異有統計學意義(P<0.05),TNBC中CPA4表達明顯高于乳腺增生組織,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

圖1 TNBC、乳腺增生組織中CPA4的免疫組織化學圖(200×)

表1 TNBC、Non-TNBC及乳腺增生組織中CPA4表達[n(×10-2)]

2.2 CPA4表達在TNBC中與患者臨床病理特征的關系 168例TNBC中CPA4表達與患者年齡、絕經狀態、脈管浸潤、腫瘤大小、組織學分級、TNM分期差異均無統計學意義(P>0.05)。CPA4陽性組淋巴結轉移率為59.4%,CPA4陰性組淋巴結轉移率為38.9%,差異具有統計學意義(P<0.005)。CPA4陽性組Ki-67為84.4%,而CPA4陰性組Ki-67為70.8%,差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 CPA4表達與三陰性乳腺癌臨床病理特征關系[n(×10-2)]

2.3 TNBC中CPA4表達與干性及EMT標志的關系 TNBC中干性標志ALDH1表達陽性率16.68%(28/168),NANOG表達陽性率32.14%(54/168),見圖2。而EMT相關標志E-cadherin陽性率為50.0%(84/168),Vimentin陽性率為45.83%(77/168),EGFR陽性率為65.48%(110/168),見圖3。168例TNBC中CPA4表達與患者ALDH1無關(P>0.05),但與NANOG、E-cadherin、Vimentin、EGFR差異有統計學意義(P<0.05),見表3。

圖2 TNBC中ALDH1、NANOG的免疫組織化學圖(200×)

圖3 TNBC中E-cadherin、Vimentin的免疫組織化學圖(200×)

表3 TNBC中CPA4表達與干性及EMT標志的關系[n(×10-2)]

2.4 siRNA沉默CPA4抑制乳腺癌細胞增殖、克隆形成及干性成球 siRNA沉默乳腺癌細胞MDA-MB-231中CPA4表達,Q-PCR及Western Blot顯示si-CPA4明顯抑制MDA-MB-231中CPA4的mRNA及蛋白表達,見圖4A、B。MTT實驗提示細胞增殖受到抑制。克隆形成實驗提示CPA4沉默組細胞克隆形成能力降低,細胞成球實驗顯示CPA4沉默組細胞成球能力降低,見圖4D、E。

圖4 siRNA沉默CPA4抑制乳腺癌細胞增殖、克隆形成及干性成球

2.5 siRNA沉默CPA4抑制乳腺癌細胞侵襲、遷移、干性及EMT相關蛋白表達 劃痕實驗提示si-CPA4抑制MDA-MB-231遷移,細胞侵襲實驗提示si-CPA4抑制MDA-MB-231侵襲。Western Blot提示si-CPA4抑制干性蛋白ALDH1、NANOG表達,并抑制EMT相關蛋白Vimentin表達,促進E-cadherin表達。見圖5。

3 討論

TNBC有高轉移、易復發,預后較差的臨床特點,缺乏內分泌治療及靶向治療點,臨床治療面臨較大困難[9]。本研究發現CPA4在TNBC中表達率為57.14%,但CPA4在非TNBC乳腺癌及乳腺增生組織中的表達顯著減少。CPA4與TNBC患者干性蛋白NANOG干性標志物高表達有關,CPA4在TNBC組織中與低E-cadherin表達,但與Vimentin、EGFR高表達有關,表明TNBC中CPA4可能與腫瘤干性進展及EMT相關,是重要的CSCs和EMT調節因子。

腫瘤組織中極少量致瘤性細胞亞群具有無限增殖的潛能,在啟動腫瘤形成和維持生長中起決定性作用,是腫瘤形成的起始細胞,也稱為腫瘤起始細胞(tumor initiating cells,TICs)[10]。CSCs處于休眠狀態,卻在腫瘤的發生、進展、轉移及復發中發揮關鍵作用[11]。CPA4促進了肝癌干性蛋白CD133、ALDH1及CD44表達,食管癌中CPA4也可調控ALDH1表達,表明CPA4在惡性腫瘤干性中發揮一定作用[12-13]。TNBC富含干細胞,是其容易復發、轉移的重要原因,ALDH1參與了乳腺癌干性進展[14]。本研究發現TNBC中CPA4陽性組有更高的ALDH1表達,可能參與TNBC干性調控。NANOG是癌細胞干細胞樣相關蛋白,導致腫瘤生長擴張、自我更新、轉移形成和腫瘤復發[15]。本組研究發現TNBC中CPA4表達與NANOG相關,CPA4陽性組有更高的NANOG表達。沉默CPA4抑制TNBC細胞干性成球,抑制干性蛋白ALDH1及NANOG表達,進一步表明CPA4可能參與TNBC干性調控。

上皮-間質轉化是細胞可塑性發展、分化、癌細胞遷移和腫瘤轉移的關鍵步驟之一[16]。EMT是上皮細胞獲得遷移能力的有效方式,也是占成體惡性腫瘤90%的上皮腺癌浸潤和轉移的重要途徑[17]。EMT型細胞具有浸入基底膜能力和細胞骨架改變便于細胞移動等變化,增加細胞浸潤和移動能力、增加抗凋亡信號,成為循環腫瘤細胞(Circulating tumor cells,CTCs),獲得轉移和浸潤能力[18]。腫瘤細胞經歷EMT獲得浸潤特性,易于浸入細胞基質,有利于腫瘤進展和轉移[19]。本研究表明CPA4與低E-cadherin、高Vimentin表達有關,沉默CPA4抑制MDA-MB-231的Vimentin表達,表明CPA4參與TNBC的EMT調控。最近,EGFR通路參與TNBC侵襲、轉移及干性進展中逐步受到重視,可能作為TNBC新的有效的輔助治療靶點[20]。本組研究表明CPA4與TNBC中EGFR相關,可能協同促進TNBC惡性進展。

另外,本研究表明沉默CPA4的顯著抑制MDA-MB-231細胞增殖,抑制克隆形成。以往的數據也表明CPA4通過調控AKT/c-MYC通路,激活STAT3及ERK中發揮一定作用,參與調控非小細胞肺癌等腫瘤增殖[21-22]。

4 結論

本研究表明CPA4在TNBC干性進展及EMT轉換過程中可能發揮一定作用,在TNBC增殖、轉移、干性進展等方面具有一定價值,需要進一步闡明TNBC中CPA4分子機制。