ANRIL,PON基因及其交互效應對急性缺血性腦卒中后認知損傷的影響*

劉生剛 肖雷 段園園 鄧小紅 王亞軍 柳華

(1.綿陽市人民醫院神經內科·川北醫學院,四川 綿陽 621053;2.成都市第三人民醫院·西南交通大學附屬醫院神經內科,四川 成都 610014)

腦卒中是我國居民首位死因,目前發病率為246.8/10萬,死亡率為114.8/10萬[1-2],而缺血性卒中(Ischemic stroke,IS)是腦卒中的主要類型,占所有腦卒中的43.7%～78.9%[1]。卒中后認知損傷很常見,超過70%的卒中患者在病后3月后會出現不同程度認知損傷(Cognitive impairment,CI),導致失能和死亡率增加,給患者、照護者、家庭、醫療系統和社會增加了嚴重負擔[3]。其中,IS急性期CI發生率約為30%～50%[4-5]。因此,研究急性IS后認知損傷(Post stroke cognitive impairment,PSCI)的危險因素,對于預防和針對性治療極為重要[6]。認知損傷具有明確的遺傳背景,研究發現,24%的認知損傷可歸因于遺傳易感因素[7]。最近一個全基因組關聯分析(Genome-wide association study,GWAS)在3個蘇格蘭人群中證實IS的多基因風險與PSCI密切相關[8]。長鏈非編碼RNA家族的INK4基因座中反義非編碼RNA(Antisense non-coding RNA in the INK4 locus,ANRIL)與IS發病密切相關[9]。ANRIL參與了炎癥和神經功能失調的調節,可能在阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)的發病機制中起作用[10]。研究者在AD細胞模型中也發現ANRIL表達上調,通過沉默ANRIL可以減少細胞凋亡,增強神經突觸生長,并降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、L-6和IL-17的水平[11]。對氧磷酶(Paraoxonase,PON)參與脂質代謝,和動脈粥樣硬化過程關系密切。Meta分析顯示,PON基因單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism,SNP)與IS的發病具有緊密相關性[12-14];PON1 L55M(rs854560)與血管性癡呆(Vascular dementia,VaD)[15],PON2 S311C(rs7493)和rs705379與AD的發病風險相關[16]。由此推測,ANRIL和PON基因可能是PSCI的發生遺傳易感因素,并且,PSCI是一個多因素疾病,本研究旨在探討上述2個基因及其與CI傳統危險因素的交互效應,以期為PSCI的防治提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取綿陽市人民醫院神經內科連續入院的符合納入標準的漢族初發IS患者。納入標準:①符合世界衛生組織(WHO)IS診斷標準。②發病14天內,發病前無認知障礙及其他影響智能的神經精神疾患。③患者及家屬知情并簽署知情同意書,同時經醫院倫理委員會審核通過。排除標準:①腔隙性腦梗死、有明確原因的繼發性腦梗死、再發性腦梗死患者。②伴有意識障礙、言語障礙、嚴重視聽損害不能進行認知評測者。③存在其他嚴重合并癥和并發癥者;④影像學發現腦白質病變、腦萎縮者。

1.2 研究方法

1.2.1 評價指標 ①認知評定:發病后2周采用簡易智能量表(Mini-mental State Examination,MMSE)中國版本進行認知測定,MMSE<27分診斷為認知損傷。②神經功能缺損評定:使用美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)進行評估,神經功能損傷程度較重定義為NIHSS>5(非輕型卒中)。③高同型半胱氨酸(HHCY)定義采用2011中國高血壓防治指南修訂委員會制定的標準:血漿Hcy>10 μmol/L。④高危CRP定義為hs-CRP>3.0 mg/L。⑤高尿酸定義采用中國高尿酸血癥與痛風診療指南(2019)定義:為非同日兩次血尿酸水平>420 μmol/L。⑥入院高血糖參照1998年WHO標準:空腹 ≥ 7.0 mmol/L,或者隨機 ≥ 11.1 mmol/L。⑦ 入院高血壓根據1999年WHO高血壓標準:即收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg。⑧吸煙史定義為平均每日吸煙1支以上,時間大于一年;飲酒史定義為平均每周飲白酒至少一次,時間大于一年)[17]。⑨血脂異常診斷依據中國成人血脂異常防治指南(2016年修訂版):甘油三酯(TG)≥1.7 mmol/L(150 mg/dl)、血漿膽固醇(TC)≥5.18 mmol/L(200 mg/dl)、高密度脂蛋白(HDL-C)<1.04 mmol/L(40 mg/dl)、低密度脂蛋白(LDL-C)≥3.37 mmol/L(130 mg/dl)。⑩超重定義為BMI≧24 kg/m2。頸動脈狹窄程度:在最大斑塊位置,采用NASCET方法計算頸動脈狹窄率,將頸動脈狹窄程度分為:正常、輕度狹窄(1%～49%)、中度狹窄(50%～69%)、重度狹窄(70%～99%)、血管閉塞(血栓填塞,血流信號消失)。梗死面積定義(CT/MRI):根據Pullicino公式,將腦梗死面積分為大、中、小三型,其中小梗死灶<4 mL,中梗死灶5～10 mL,大梗死灶>10 mL。

1.2.2 SNP分型

1.2.2.1 ANRIL SNPs位點的選擇 根據在Hapmap數據庫(HapMap Data Phase III/Rel#2,Feb09,on NCBI36 B36 assembly,dbSNP b126)中獲得的中國非親緣關系北京人群的所有SNP基因分型數據,挑選出r2≥0.8且最小等位基因頻率(MAF)> 5%的SNPs作為標簽SNPs。位于5′和3′側翼區以及非轉錄區(UTRs)的SNPs也納入分析。最后,15個SNP位點納入分析,包括rs2184061,rs7044859,rs10738607,rs1537375,rs1004638,rs10738609,rs10757278,rs10757274,rs2383206,rs1333049,rs1333040,rs10116277,rs10757269,rs1537378和rs7865618。

1.2.2.2 PON位點選擇 選擇在腦血管疾病及認知功能研究較多的位點,共涉及9個位點(rs12026、rs3735590、rs662、rs705379、rs705381、rs7493、rs854560、rs854571和rs854572)。

1.2.2.3 DNA提取 取每個受試者外周靜脈血2 mL于內含EDTA-K2(K3)抗凝劑的紫頭管,于-80 ℃冰箱保存。采用北京TIANGEN公司提供的血液基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Blood DNA Kit)(離心柱型),目錄號:DP348)提取DNA。

1.2.2.4 SNPs分型采用SNPscan方法(Cat#:G0104K,上海天昊生物科技有限公司) 該技術是根據提供的SNP信息合成特異引物并優化連接反應體系后組裝而成。實驗步驟簡述如下:①DNA樣本濃度在30～50 ng/ul。②樣本裂解:使用2.5 ul 4x DNA lysis Buffer,在PCR儀上98 ℃,5 min裂解。③連接反應:使用裂解DNA樣本,加入10 μL連接反應預混合液,3 000 rpm離心0.5 min,在PCR儀按以下程序運行:第一步,4個循環,包括:94 ℃,1 min,58 ℃,4 h;第二步,94 ℃,2 min,72 ℃保持。④多重熒光PCR反應(每個樣本進行兩個PCR反應,每個反應各擴增48位點的連接產物),連接產物1 ul加19 ul PCR預混合液,3000 rpm離心0.5 min,然后在PCR儀按以下程序運行:第一步,95 ℃,2 min變性,第二步,9個循環:94 ℃,20秒變性,首次循環62 ℃,40秒退火(后續每個循環降低0.5 ℃),72 ℃延伸1.5 min;第三部,25個循環:94 ℃,20秒變性,首次循環57 ℃,40秒退火,72 ℃延伸1.5 min;第四步,68 ℃ 60 min延伸。⑤PCR產物上ABI 3730XL測序儀:PCR產物稀釋10倍后,取1 ul與0.5 ul Liz 600 SIZE STANDARD,8.5 ul Hi-Di混勻,95 ℃變性5 min后上ABI 3730XL測序儀。⑥數據分析:ABI 3730XL測序儀上收集的原始數據用軟件GeneMapper 4.1(AppliedBiosystems,USA)分析。

2 結果

2.1 一般資料 研究期間,共納入312例急性IS患者,根據納入排除標準,共255例IS患者進入本研究分析。根據MMSE評測,88例患者存在認知損傷,認知損傷的比例為34.5%,平均年齡(64.01±4.51)歲,男性52例,女性36例;認知正常167例,年齡(62.03±5.65)歲,男性91例,女性71例。調整協變量多因素分析后顯示,認知損傷組年齡較大,更多見大中體積梗死、非輕型梗死、頸動脈中重度狹窄和高hs-CRP值。認知正常IS患者右側梗死多見。病例組與對照組的人口統計學特征和臨床特點,見表1。

表1 PSCI和對照組臨床特點[M(P25,P75)]

2.2 SNPs關聯分析 在總體樣本的所有遺傳模式下,經調整協變量后,多元Logistic回歸分析顯示,5個位點影響了急性PSCI的發病,rs10116277 G等位基因攜帶者發病風險更小(P=0.001),rs1333049 C等位基因、rs12026和rs7493位點GG基因型、以及rs3735590位點A等位基因增加了發病風險(P<0.05)。見表2。

2.3 交互作用分析 采用MDR軟件評估總人群PSCI可能的基因-基因,基因-傳統危險因素交互作用的影響,PSCI傳統危險因素分析中P≤0.10的因素都被納入交互分析。我們發現,在基因-基因交互作用分析中,三階交互模型rs10116277、rs3735590和rs7493是最佳模型。在基因-傳統危險因素交互分析中,ANRIL rs10116277、rs1333049和hsCRP三階交互,rs10116277、rs1333049和右側腦梗死的三階交互,rs10116277、rs1333049和大中面積梗死體積的三階交互,rs10116277和中重度頸動脈狹窄的二階交互,rs10116277、rs1333049和65歲及以上人群的三階交互,PON rs7493與右側腦梗死二階交互,rs3735590

與大中面積梗死體積的二階是最佳模型,具有最高TBA。然而,在Logistic回歸分析中,只有ANRIL rs10116277、rs1333049和hsCRP,rs10116277、rs1333049和大中面積梗死體積,rs10116277和中重度頸動脈狹窄,PON rs7493和右側腦梗死,rs3735590和大中面積梗死體積交互作用具有統計學意義,見表3。Logistic回歸分析用來評估最佳交互模型對PSCI的效應,調整協變量后,本研究發現,攜帶ANRIL rs10116277 TT基因型和rs1333049 CC基因型的高hsCRP患者,發生急性PSCI的比率為5.049倍(OR=5.049,95%CI:1.650～15.448,P=0.005);攜帶ANRIL rs10116277 TT基因型,rs1333049 CC基因型的大中面積腦梗死患者,發生急性PSCI的比率為8.322倍(OR=8.322,95%CI:2.458～28.171,P=0.001);rs10116277 TT攜帶者加上頸動脈中重度狹窄,PSCI發生率為4.067倍(OR=4.067,95%CI:1.832～9.027,P=0.001);rs3735590 GG攜帶者加上大中面積梗死,PSCI發生率為5.176倍(OR=5.176,95%CI:2.343～11.436,P<0.001)。其它交互效應未見統計學意義。

3 討論

本研究通過分析動脈粥樣硬化相關基因ANRIL與PON的SNP位點與PSCI發病風險相關性,發現了新的PSCI潛在預測指標。本研究還發現,5個SNPs位點影響了急性PSCI的發病,rs10116277 G等位基因具有保護效應,rs1333049 C等位基因、rs12026和rs7493 GG基因型、rs3735590 A等位基因增加了PSCI發病風險。

ANRIL是染色體9p21區域一段長3.8 kb的非編碼RNA,廣泛參與了動脈粥樣硬化疾病的發生[9,18]。在大鼠糖尿病模型中,ANRIL下調能重建學習和記憶能力,避免海馬錐體神經元的凋亡[19]。在AD細胞模型中,ANRIL敲除能抑制凋亡和炎癥因子細胞因子表達,促進神經突的生長[10]。這些都是AD發病的關鍵機制。研究也發現,ANRIL rs10116277位點風險等位基因增加了白人群體冠脈病變發生1.45倍[20]。在高加索人群中,冠狀動脈旁路移植術后,rs10116277風險基因攜帶者更易出現心肌損傷[21]。在中國AD人群中研究發現,rs1333049 C等位基因增加了晚發性AD的發生[22]。在意大利人群中,rs1333049 C等位基因也增加了VaD和晚發性AD的發病風險[23]。

表2 5個SNPs位點在不同遺傳模型下在認知損傷組和正常組中的分布情況

表3 ANRIL,PON基因交互作用模型表

PON是高密度脂蛋白相關的有機磷酸酯水解酶,具有水解內酯、硫內酯、芳基酯和不同有機磷酸鹽的能力,具有抗動脈粥樣硬化的生理作用[24]。PON基因與動脈粥樣硬化相關疾病具有密切關系,在Gran Canaria島北部地區,rs7493 GG基因型增加了頸動脈IMT的風險[25];在新加坡華人中,不吸煙人群中rs3735590少見等位基因(A)攜帶者患CHD的風險更高[26]。GWAS研究也揭示,PON1基因一個SNP與AD發病風險有關[27]。Meta分析顯示,PON1 L55M (rs854560) M等位基因有更高的VaD發病風險[15]。綜上,ANRIL,PON基因與動脈粥樣硬化疾病關系密切,本身也涉及到認知損害的病理生理過程,因此,可以理解ANRIL,PON基因與急性PSCI發病風險的關系。

本研究交互作用分析也發現,攜帶ANRIL rs10116277 TT基因型和rs1333049 CC基因型的高hs-CRP患者,攜帶ANRIL rs10116277 TT基因型和rs1333049 CC基因型的大中面積腦梗死患者,攜帶rs10116277 TT基因型的頸動脈中重度狹窄患者,以及攜帶rs3735590 GG基因型的大中面積梗死患者PSCI發生率顯著升高。

卒中后認知損傷風險因素眾多,比如高齡(65歲以上)、血管危險因素、梗死部位大小等本身特點以及遺傳易感因素等交互而成[28]。在CHD患者中,rs1333049 CC基因型被發現與升高的CRP有關[29],ANRIL過表達增加了糖尿病心肌梗死鼠的心肌梗死體積[30],頸總動脈狹窄患者ANRIL表達更低[31]。上述基因與傳統危險因素的復雜相互作用有助于我們理解上述的交互效應,對于IS后急性期CI的防治極其重要。

ANRIL和PON基因與PSCI研究甚少,前期,本研究團隊報道在川東北人群PON基因與PSCI存在關聯[32],然而,由于認知測試方法差異,以及PSCI本身是一個多因素疾病,基因多態性有較強的種族及地域差異性,因此,以SNP作為遺傳標志物,在川西北PSCI人群中,研究其遺傳關系及相互交互作用,對于揭示PSCI發生機制更有優勢。本研究成果不僅豐富了目前對PSCI遺傳特性的認知,也為臨床診療提供了參考。本研究也存在一定缺陷,如納入分析樣本來源范圍較窄、數量較小等,后期研究結果的進一步驗證還需要擴大病例納入范圍及數量。

4 結論

ANRIL,PON基因與PSCI發病風險密切相關。為了解IS人群后期認知障礙的發病、進展、轉歸、治療情況與本研究基因的關系,應對研究對象進行長期隨訪觀察,建立資料庫進行對比研究。