基于D值法的煙草苗期抗旱評價方法研究及抗旱材料篩選

陳 剛, 喻奇偉, 熊 晶, 舒彥淇, 陸安彬, 龍本山, 劉仁祥

(1.貴州大學農學院/貴州省煙草品質研究重點實驗室, 貴陽 550025; 2.貴州大學煙草學院/貴州省煙草品質研究重點實驗室, 貴陽 550025;3.貴州省煙草公司畢節市公司, 貴州 畢節 551700)

干旱是影響作物生長的主要非生物脅迫因子之一,干旱脅迫會導致作物減產50%甚至于全年失收[1]。煙草 (NicotianatabacumL.)起源于熱帶,整個生育期需水量較大[2-3]。干旱脅迫會影響煙葉生長發育,導致產量降低與品質下降[4-5]。煙草是我國西南地區鄉村振興的重要經濟作物,而西南地區春旱時常發生,對煙葉產量和質量產生了明顯的不利影響[6]。因此,選擇和培育苗期煙草抗旱品種對我國煙葉生產具有重要意義。作物的抗旱性是干旱脅迫下多種生理代謝作用的結果,難以用某種單一的指標來對其進行評價[7-8]。目前,對抗旱性進行評價主要是通過綜合評價法[9]。在綜合評價中,抗旱系數(DC)能夠消除各指標量綱差異,還能表示各材料在某個指標上的抗旱性強弱[10]。此外,評價指標的選擇和各指標的權重尤為重要,抗旱性度量值(D)充分考慮了干旱脅迫下各指標的權重,是一種可靠的評價方法[11]。蔡建國等[12]采用D值法對繡球進行抗旱性評價,并構建了繡球抗旱性評價方法。目前,D值法在煙草苗期抗旱性評價研究中已有報道[13],但煙草苗期抗旱性評價方法相關研究鮮有報道。前期,本課題組觀察到NC82×畢納一號組合的多個高世代株系對干旱脅迫表現出明顯的抗性差異,但各株系的抗旱性有待準確鑒定,尤其是苗期抗旱性快速評價方法有待建立。為此,本研究從NC82×畢納一號組合的F6及以上高世代品系中,選擇在田間干旱條件下表現出明顯差異的21個品系,以其5葉1心的煙苗為材料,采用PEG-6000模擬干旱處理,通過測定葉綠素a等10項指標,構建了煙草苗期抗旱性評價方法,對參試材料的抗旱性進行了評價,以期為煙草抗旱品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為NC82×畢納一號組合的F6及以上高世代品系,根據田間抗旱性觀察結果,選擇抗旱性差異明顯的21份材料。材料由貴州大學貴州省煙草品質研究重點實驗室提供。

1.2 試驗設計

試驗設置干旱脅迫(15% PEG-6000模擬干旱)和正常對照2個處理,各3個重復,每重復5株。試驗于2021年在貴州大學煙草學院光照培養室進行,采用漂浮盤育苗,待苗長至4葉1心時將苗從漂浮盤上取出,將根洗凈后水培至5葉1心時進行模擬干旱處理,處理48 h取煙苗倒二葉鮮樣于液氮中暫存,取樣結束后于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3 測定指標與方法

葉片相對含水量(RWC)測定采用稱重法[14],葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量采用95%乙醇浸提法[15],MDA含量采用硫代巴比妥酸法[16],Pro含量采用茚三酮法[17],SOD、POD、CAT活性分別使用蘇州格銳思生物科技有限公司的酶活試劑盒測定,H2O2含量使用南京建成生物科技有限公司試劑盒測定。

1.4 數據處理與統計分析

利用Excel2016軟件對試驗數據進行整理分析,用DPS7.05軟件對數據進行相關性分析、主成分分析、聚類分析和通徑分析。參照李紀潮等[18]和鄭巨云等[19]方法,分別計算各單項指標的抗旱系數(DC)、隸屬函數值(μ(Xi))和抗旱性度量值(D)。計算公式如下:

DC=干旱脅迫測定值/對照測定值

(1)

(2)

負向指標的隸屬函數值:

(3)

式中,Xi、Xmin和Xmax分別為第i個綜合指標及該指標的最小值和最大值。

(4)

(5)

式中,ωi表示第i個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度,Pi為第i個綜合指標的貢獻率。

2 結果與分析

2.1 各單項指標的抗旱系數分析

由表1可知,干旱脅迫下,煙草苗期的10項生理指標變異系數在7.7%～75.6%之間,說明21份材料的各項生理指標對干旱脅迫的響應存在明顯差異。其中,類胡蘿卜素、MDA、H2O2、CAT、Pro的變異系數均在40.0%以上,分別為75.6%,44.0%,42.6%,41.9%和44%,說明這5項指標干旱脅迫后變化較大。而POD和葉片相對含水量的變異系數均小于20.0%,分別為9.8%和7.7%,說明POD和葉片相對含水量受干旱脅迫影響較小。此外,干旱脅迫后10項生理指標抗旱系數均值在0.837～2.388之間,10項指標在干旱脅迫下變化有所不同,其中,除葉綠素a、葉綠素b、POD及葉片相對含水量外其他指標均值均大于1,說明干旱脅迫下煙草葉綠素含量降低、葉片失水,而活性氧增加導致細胞膜受到破壞。同時,為適應干旱脅迫,煙草幼苗內滲透調節物質增加以維持細胞滲透壓并通過激活抗氧化酶系統(SOD、CAT)來清除活性氧,維持干旱脅迫下的正常生長。進一步觀察21個材料各指標的抗旱系數發現,干旱脅迫后同一指標在不同材料間變化趨勢有所不同,如干旱脅迫后SOD在1號、4～5號、8號、16～17號、19號、21號材料中降低,而在2～3號、6～7號、9～15號、18號、20號材料中上升。說明21份材料對干旱的響應存在差異,而各指標在不同材料中的變化趨勢和程度不同,很難用單一的指標來判斷各材料間的抗旱性差異,應當用多個指標對各個材料的抗旱性進行綜合評價。

表1 干旱脅迫后各指標抗旱系數Table 1 Drought resistance coefficient of indicators after drought stress

2.2 抗旱性評價指標篩選

由于不同材料間各指標變化趨勢不一致,采用單一指標對供試材料進行抗旱性評價具有片面性,因此需要多指標綜合考慮。通過各指標相關性分析(表2)表明,葉綠素a與類胡蘿卜素呈極顯著正相關,與CAT呈極顯著負相關;葉綠素b與類胡蘿卜素呈顯著正相關,與CAT呈顯著負相關;類胡蘿卜素與CAT呈顯著負相關; H2O2與Pro呈極顯著正相關;葉片相對含水量與H2O2呈極顯著負相關,與Pro呈顯著負相關。這說明10項生理指標中存在相互關聯,反映煙苗對干旱脅迫的響應存在信息重疊,因此需對這10項指標進行主成分分析,用以篩選抗旱性評價指標。

表2 各指標相關性分析Table 2 Correlation analysis of indicators

對21份煙草材料10項生理指標進行主成分分析,結果(表3)表明,前5個主成分的貢獻率分別為31.329%,22.339%,14.206%,9.442%和8.562%,累積貢獻率達到85.877%,特征值的累積貢獻率超過80.000%,說明前5個主成分能夠有效反映材料85.877%的抗旱性信息,因此將前5個主成分作為21份煙草材料苗期抗旱性評價的主要因子。在主成分1中葉綠素a含量具有較高的載荷量(0.538),在主成分2中H2O2含量具有較高的載荷量(0.576),在主成分3中MDA含量具有較高的載荷量(0.663),在主成分4中SOD活性具有較高的載荷量(0.674),在主成分5中,除MDA外,POD活性具有較高的載荷量(0.549)。綜合主成分分析,分別選擇5個主成分中載荷量較高的指標(葉綠素a、H2O2、MDA、SOD、POD)作為煙草苗期抗旱性評價指標。

表3 各指標主成分分析Table 3 Principal component analysis of each indicator

2.3 煙草苗期抗旱性評價方法構建

以抗旱性度量值(D)作為評價標準,D值越大,代表供試材料抗旱性越強。由表4可以看出,21個材料的抗旱性存在明顯差別,供試材料的D值在0.301～0.858之間,其中D值最大的為2號材料,D值最小的為1號材料。

表4 供試材料抗旱性評價的D值Table 4 D value of drought resistance evaluation of test materials

為探究煙草苗期抗旱性快速評價方法,以D值作為因變量,以篩選出的5個指標的抗旱系數作為自變量進行通徑分析,得到關于D值與各指標抗旱系數的回歸方程(表5)Y=0.044+0.471X1-0.065X2-0.106X3+0.068X4+0.305X5,其中,X1～X5分別代表葉綠素a、MDA、H2O2、SOD和POD。回歸方程的決定系數分別為R2=0.999,p=0.000 1達到極顯著水平,說明該回歸方程擬合度好,可以作為煙草苗期的抗旱性預測模型。由預測模型可知,干旱脅迫后葉綠素a含量、MDA含量、H2O2含量、SOD活性和POD活性對煙草苗期抗旱性具有顯著影響,可以作為煙草苗期抗旱性評價的指標。由表6可知,干旱脅迫后葉綠素a含量(X1)與D值呈極顯著相關性,表明干旱脅迫后葉綠素a含量(X1)對D值的直接作用大于間接作用總和,對D值起主要作用,而其余指標對D值的貢獻主要是通過干旱脅迫后葉綠素a含量間接實現,因此可以將葉綠素a作為煙草苗期抗旱性評價的關鍵指標,通過比較各材料葉綠素a的抗旱系數可以對煙草苗期抗旱性進行快速評價。

表5 供試材料的抗旱性模型預測Table 5 Drought resistance model prediction of test materials

表6 各綜合指標的通徑分析Table 6 Diameter analysis of each comprehensive indicator

2.4 煙草苗期抗旱材料篩選

利用構建出的抗旱性預測模型(Y)和快速評價指標葉綠素a的抗旱系數(DCChla)對供試材料進行抗旱性評價(表7),兩種方法各材料順序相似,部分材料排名不一致,表明通過比較各材料葉綠素a的抗旱系數可以對煙草苗期抗旱性進行初步評價,利用葉綠素a可以將抗旱性差異較大的材料篩選出來,但差異較小的材料仍需抗旱性模型進行評價。

表7 兩種方法評價結果Table 7 Evaluation results of the two methods

分別對21份材料的預測模型值(Y)和葉綠素a的抗旱系數(DCChla)進行聚類分析(圖1),兩種方法均可將21份材料分為5類,分別為高抗、中抗、抵抗、不抗和敏感型。綜合兩種分析結果,在高抗和中抗兩種類群中篩選出同時出現的2號、4號、6號和19號抗旱性較強的材料,作為抗春旱品種選育的種質資源。

注:左為Y值,右為DCChla。圖1 21份材料D值聚類分析Fig.1 Cluster analysis of D values of 21 materials

3 討 論

3.1 煙草苗期對干旱脅迫的生理響應

干旱脅迫會導致煙草的生長發育受到影響。Han等[20]研究指出,干旱脅迫下煙草幼苗內活性氧(H2O2)增多,活性氧會對蛋白質、脂類和脫氧核糖核酸造成氧化損傷,從而損害細胞的正常功能[21];細胞膜受到破壞,MDA含量增多;葉片水分流失、葉綠素及類胡蘿卜素含量降低,光合速率減弱,從而導致煙草幼苗生長發育緩慢。此外,梁棟等[22]指出,干旱脅迫還會加快煙苗細胞程序性死亡(PCD)的進程,且干旱敏感品種較抗旱品種發生細胞程序性死亡(PCD)時間較早。為應對干旱脅迫,煙草通過多種生理代謝過程來減少水分流失和活性氧損傷,Jha等[23]通過SbCDR基因在煙草中的過表達研究發現,過表達植株較野生種具有較強的抗旱性,且轉基因煙草植株中Pro及可溶性糖含量顯著高于野生種;Khan等[24]研究表明,干旱脅迫后,煙草中抗氧化酶(POD,CAT,APX)活性和原性保護物質(AsA)含量抗氧化酶相關基因的轉錄水平(CAT,APX1和GR2較高),抗氧化酶活性增加能夠有效地消除細胞中的活性氧,降低細胞氧化損傷。本研究發現,干旱脅迫導致葉片失水,葉片含水量降低,同時H2O2含量、MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性及Pro含量升高,這說明干旱脅迫對煙草幼苗的生理代謝造成損傷之后,煙草通過激活抗氧化酶和增加細胞滲透調節能力來響應干旱。光合色素的變化在干旱脅迫的不同時間有所不同,在短時間(48 h)干旱脅迫下葉綠素含量普遍降低,這與Han等[20]研究結果一致。而汪志威[25]和吳迪等[26]研究則表明,長時間(8 d)干旱脅迫下,葉綠素含量增加。這可能是由于早期干旱脅迫導致葉綠素被破壞,而經歷持續干旱脅迫后,葉綠素也能夠作為一種響應因子來降低干旱脅迫損傷,而具體的響應機理目前鮮有報道,因此還需進一步深入研究。

3.2 煙草苗期抗旱性評價

作物的抗旱性是多種生理響應機制共同作用的結果,因此對作物抗旱性進行評價時,評價指標的選擇尤為重要[27-28]。目前對于抗旱性評價指標的篩選已有大量研究,但指標篩選的方法各有不同。如郭瑩等[29]通過灰色關聯度分析指出,灌漿期不同麥類種質的熒光系數與抗旱指數關聯度最高,可以利用熒光系數來評價不同麥類種質灌漿期抗旱性。程少波等[30]利用主成分分析指出,活力指數和根長是評價多花黑麥草萌發期抗旱性強弱的關鍵指標。在這些方法中,主成分分析能將各抗旱指標進行綜合簡化,客觀評價各指標權重,避免主觀隨意性,是一種客觀的指標選擇方法[31]。在煙草中,汪志威[25]和吳迪等[26]通過各指標與隸屬函數值的相關關系分析,指出葉綠素a等可以作為煙草苗期抗旱性評價指標。本試驗通過對10項生理指標進行主成分分析,選擇出5個指標用作煙草苗期抗旱性評價的重要指標,在前人研究基礎上又篩選出了活性氧(H2O2)和抗氧化酶(POD)兩個評價指標,完善了煙草苗期的抗旱性評價指標篩選。

通過篩選出來的指標對供試材料進行抗旱性評價,目前,對作物的抗旱性評價主要包括模糊隸屬函數、抗旱性度量值法(D)等評價方法。在眾多評價方法中,汪燦等[11]研究認為,D值的評價結果與田間表現更接近,是一種更可靠的評價方法。盛偉等[32]利用D值法對41份木豆材料進行抗旱性評價并篩選出11份高抗旱性材料。閆成川等[33]也用D值法篩選出了包括JK625等14份陸地棉花鈴期抗旱材料。在煙草抗旱性研究中李顯航等[13]利用D值法篩選出煙草苗期高抗旱性品種TN90和紅花大金元,而煙草的抗旱性評價方法構建相關研究鮮有報道。本試驗利用D值法對21份煙草材料苗期抗旱性進行綜合評價,基于D值構建煙草苗期抗旱性評價模型(Y=0.044+0.471X1-0.065X2-0.106X3+0.068X4+0.305X5,其中,X1～X5分別代表葉綠素a、MDA、H2O2、SOD和POD)和快速評價指標(DCChla)。通過模型和快速評價指標將21份材料分為高抗型、中抗型、低抗型、不抗型和敏感型,從21份材料中篩選出4份苗期抗旱性較強的煙草材料。

4 結 論

本試驗通過對干旱脅迫后21個材料的生理指標進行綜合評價,從10個生理指標中篩選出葉綠素a、H2O2、MDA、SOD和POD等5項指標用作煙草苗期抗旱性評價指標。構建了煙草苗期抗旱性評價模型,模型表明,葉綠素a與煙草苗期抗旱性直接相關,說明通過干旱脅迫后葉綠素a的變化可以對煙草苗期抗旱性進行初步評價。利用兩種快速評價方法將21個供試材料分為高抗型、中抗型、低抗型、不抗型和敏感型5種類型,篩選出4份煙草材料作為煙草苗期抗旱育種的種質資源,本研究為煙草苗期抗旱品種篩選與抗旱新品種的選育提供理論依據。