西北早粳稻核心種質(zhì)資源蛋白質(zhì)含量全基因組關(guān)聯(lián)分析

馬 偉, 孫志勇, 劉 陽(yáng), 徐 強(qiáng), 楊小麗, 陳思怡, 李培富

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院/寧夏優(yōu)勢(shì)特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 銀川 750021)

隨著生活質(zhì)量的提高,人們對(duì)稻米品質(zhì)的要求也越來(lái)越高,亟需培育出更加優(yōu)質(zhì)的水稻新品種滿足市場(chǎng)需求。蛋白質(zhì)作為稻米中含量?jī)H次于淀粉的第二大干物質(zhì),一般含量在8%左右,對(duì)稻米的外觀品質(zhì)、加工品質(zhì)和食味品質(zhì)都有很大影響[1]。因此,通過(guò)分子輔助標(biāo)記方法挖掘出與稻米蛋白質(zhì)含量相關(guān)的基因,對(duì)稻米品質(zhì)改良具有重要意義。

分子輔助標(biāo)記方法在植物分子育種中被廣泛應(yīng)用。奉杰等[2]以玉米骨干自交系ZNC442和SCML0849為親本構(gòu)建的131份F2∶3家系為材料,基于簡(jiǎn)化基因組測(cè)序方法對(duì)該群體進(jìn)行基因型鑒定,利用ICIM軟件的完備區(qū)間作圖法對(duì)粒長(zhǎng)、粒寬、百粒重等性狀進(jìn)行QTL定位,定位到23個(gè)與粒長(zhǎng)相關(guān)QTLs,29個(gè)與粒寬相關(guān)QTLs,20個(gè)與百粒重相關(guān)QTLs。彭強(qiáng)等[3]以V20B/CPSLO17遺傳背景衍生的150份重組自交家系作為作圖群體,在3種環(huán)境下分別進(jìn)行糙米粒重性狀QTL檢測(cè)及其遺傳效應(yīng)分析,定位到6個(gè)與糙米粒重相關(guān)的QTLs。

目前,已克隆多個(gè)與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的基因。OsGS2為谷氨酰胺合成酶基因,Singh等[4]研究發(fā)現(xiàn),OsGS2和OsGS1;1的表達(dá)可以提高水稻植株的耐旱性。Lgc-1為低谷蛋白含量基因,Kusaba等[5]研究發(fā)現(xiàn),Lgc1通過(guò)RNA沉默抑制glutelin基因表達(dá)來(lái)降低稻米中谷蛋白含量。OsHT1為調(diào)控賴氨酸和組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成的基因,Guo等[6]研究發(fā)現(xiàn),OsLHT1在營(yíng)養(yǎng)器官向生殖器官的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中對(duì)籽粒產(chǎn)量、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和功能品質(zhì)具有重要作用。Wakasa等[7]研究發(fā)現(xiàn),OsBip1是參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中種子貯藏蛋白等分泌蛋白折疊的關(guān)鍵伴侶蛋白的調(diào)控基因,OsBiP1的嚴(yán)重抑制或過(guò)表達(dá)不僅改變了種子表型和胚乳細(xì)胞的胞內(nèi)結(jié)構(gòu),而且降低了種子貯藏蛋白含量、淀粉積累和粒重。Fang等[8]研究發(fā)現(xiàn),LNUE1編碼丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶OsAlaAT1基因的合成,調(diào)控水稻的氮素利用率、產(chǎn)量和稻米品質(zhì)。OsGluA2為谷蛋白A2前體蛋白基因,Yang等[9]研究發(fā)現(xiàn),OsGluA2通過(guò)增加籽粒存儲(chǔ)蛋白含量和氨基酸總量,正調(diào)控籽粒的蛋白含量,導(dǎo)致蛋白體Ⅱ的數(shù)量和體積都升高,提高了稻米的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。因此,通過(guò)GWAS(Genome Wide Association Study)發(fā)掘與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的基因,研究其表達(dá)機(jī)制,對(duì)水稻分子育種具有重要意義。

表1 參試水稻種質(zhì)名稱及來(lái)源信息Table 1 Name and source information of tested rice germplasm

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以139份西北早粳稻核心種質(zhì)資源為材料,2021年于海南種植,每份材料種植兩行,單株移栽,每行10株,行長(zhǎng)1.2 m,行距0.3 m,株距0.1 m,進(jìn)行常規(guī)田間管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1表型測(cè)定

采用北京東孚久恒JDMZ100稻米出米率檢測(cè)儀檢測(cè)出米率、LTJM-2099精米機(jī)加工稻谷得到精米,采用北京東孚久恒JSWL200大米食味計(jì)測(cè)定稻米蛋白質(zhì)含量,3次重復(fù)。

1.2.2SNP標(biāo)記方法

對(duì)139份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行DNA提取和質(zhì)控,建庫(kù)測(cè)序,測(cè)序深度為10×,用基因組比對(duì)軟件BWA將所有139份水稻過(guò)濾后的Clean Reads比對(duì)到日本晴參考基因組上,通過(guò)突變分析軟件GATK檢測(cè)全基因組中所有的潛在多態(tài)性SNP(Single Nucleotide Polymorphism)位點(diǎn),再根據(jù)最大缺失率(0.05)、最小等位基因頻率(0.01)等條件進(jìn)一步過(guò)濾,篩選出具有高可信度的SNP位點(diǎn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin2021b軟件對(duì)139份水稻種質(zhì)資源的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行表型數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果分析

2.1 描述性統(tǒng)計(jì)

對(duì)139份種質(zhì)資源的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì),結(jié)果表明,139份種質(zhì)資源蛋白質(zhì)含量均值為10%,變異系數(shù)為16.86%,范圍在7%～17%之間。

2.2 方差分析

對(duì)139份種質(zhì)資源的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行方差分析,結(jié)果(表2)表明,在0.05水平下,不同品種間的蛋白質(zhì)含量有顯著差異。

表2 139份種質(zhì)資源蛋白質(zhì)含量方差分析Table 2 Variance analysis of protein content of 139 germplasm resources

2.3 頻率分布

使用Origin 2021b軟件分析139份種質(zhì)資源蛋白質(zhì)含量頻率分布,作頻率分布直方圖(圖1),結(jié)果表明,139份種質(zhì)資源的蛋白質(zhì)含量主要分布在8%～12%之間。其中,蛋白質(zhì)含量在9%～10%之間的有39個(gè)品種,蛋白質(zhì)含量在10%～11%之間的有37個(gè)品種。

注:從上到下,從左到右,依次為FarmCPU曼哈頓圖、QQ圖,GLM曼哈頓圖、QQ圖,MLM曼哈頓圖,QQ圖。圖2 FarmCPU、GLM、MLM模型Fig.2 FarmCPU,GLM,MLM model

2.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

使用R包MVP進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析[10],包含了三種模型:FarmCPU、一般線性模型(GLM)和混合線性模型(MLM)。將親緣關(guān)系矩陣和主成分作為協(xié)變量加入模型進(jìn)行校正,減少親緣關(guān)系、群體結(jié)構(gòu)的影響。全基因組水平顯著閾值設(shè)置為1/markers數(shù)[11],對(duì)稻米蛋白質(zhì)含量進(jìn)行GWAS分析。設(shè)置閾值-log10(P)為5.7,篩選與稻米蛋白質(zhì)含量顯著相關(guān)的SNPs位點(diǎn)。

本試驗(yàn)共定位到3個(gè)與蛋白質(zhì)含量顯著相關(guān)的SNPs位點(diǎn)(表3),分布在1號(hào)、3號(hào)、6號(hào)染色體上,-log10(P)在5.79～6.36之間,貢獻(xiàn)率在15%～17%之間。其中1號(hào)染色體上的位點(diǎn)在LOC_Os01g19600(11105219～11108548)上游,該基因是一個(gè)轉(zhuǎn)座子蛋白基因;3號(hào)染色體上的位點(diǎn)在LOC_Os03g28120(16163989～16167050)下游,該基因是一個(gè)鉀離子通道蛋白基因;6號(hào)染色體上的位點(diǎn)在LOC_Os06g48440(29302715～29312084)上,該基因是一個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白基因。

表3 全基因組關(guān)聯(lián)分析顯著SNP位點(diǎn)Table 3 Significant SNP loci in genome-wide association analysis

2.5 候選基因預(yù)測(cè)

根據(jù)全基因組水平顯著閾值篩選出與表型顯著相關(guān)的位點(diǎn),LD(連鎖不平衡),將位點(diǎn)向上下游延伸50 kb的范圍定義為候選區(qū)間,挖掘候選基因。由表4可知,共關(guān)聯(lián)到32個(gè)與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的基因,分布在1號(hào)、3號(hào)、6號(hào)染色體上。其中包括1個(gè)已克隆的基因[OsCMO(LOC_Os06g48510)];31個(gè)未克隆的基因,包括17個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白基因,3個(gè)轉(zhuǎn)座子蛋白基因,3個(gè)三角狀五肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域基因,Kelch基序家族蛋白基因(LOC_Os01g19480),鋅離子結(jié)合蛋白基因(LOC_Os03g28140),鉀離子通道蛋白基因(LOC_Os03g28120),果膠酯酶基因(LOC_Os03g28090),Ring-H2鋅指蛋白基因(LOC_Os03g28080),OsFBX94-F-box構(gòu)域蛋白基因(LOC_Os03g28130),RPM1抗病蛋白基因(LOC_Os06g48520)等,這些候選基因的功能有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 結(jié)果與討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)139份核心種質(zhì)資源的蛋白質(zhì)含量表型數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析,共定位到3個(gè)與蛋白質(zhì)含量顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn),關(guān)聯(lián)到32個(gè)候選基因。關(guān)聯(lián)到1個(gè)已克隆的基因OsCMO(LOC_Os06g48510),該基因是一個(gè)膽堿單加氧酶基因,對(duì)水稻耐鹽性至關(guān)重要,過(guò)表達(dá)OsCMO會(huì)增加水稻對(duì)鹽脅迫的耐受性,轉(zhuǎn)基因株系中甜菜堿含量增加[12]。潘麗娟等[13-14]研究發(fā)現(xiàn),OxCMO基因在水稻幼苗組織中的表達(dá)受高鹽、低溫和干旱等脅迫的上調(diào)誘導(dǎo)表達(dá),表明該基因可能在抵御非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。關(guān)聯(lián)到31個(gè)未克隆的基因,包括17個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白基因,3個(gè)轉(zhuǎn)座子蛋白基因,3個(gè)三角狀五肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域基因,Kelch基序家族蛋白基因,鋅離子結(jié)合蛋白基因,鉀離子通道蛋白基因,果膠酯酶基因,Ring-H2鋅指蛋白基因,OsFBX94-F-box結(jié)構(gòu)域蛋白基因,RPM1抗病蛋白基因等。轉(zhuǎn)座子對(duì)基因的表達(dá)和功能有重要影響,林悅龍等[15]研究發(fā)現(xiàn),反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是許多植物基因組中的重要成分,反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的復(fù)制和移動(dòng)可以作為沉默子或終止子讓插入?yún)^(qū)域的正?；虬l(fā)生表達(dá)沉默或者翻譯提前終止,進(jìn)而使基因功能失活;也可以直接作為鄰近基因的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或者通過(guò)改變基因的剪接模式以及產(chǎn)生甲基化等來(lái)調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)與功能行使。何虎翼等[16]研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)座子是植物產(chǎn)生變異的重要來(lái)源,不同的轉(zhuǎn)座子通過(guò)不同的轉(zhuǎn)座機(jī)制插入宿主基因組,影響基因表達(dá)和功能。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn),五肽重復(fù)序列蛋白參與葉綠體或線粒體基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,包括RNA成熟,編輯,內(nèi)含子剪接,轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定和翻譯起始,對(duì)植物的光合作用,呼吸作用和發(fā)育及其環(huán)境響應(yīng)具有深遠(yuǎn)的影響。Yousefi等[18]研究發(fā)現(xiàn),鋅離子結(jié)合蛋白參與調(diào)控植物的高溫、干旱和鹽脅迫。Haque等[19]研究發(fā)現(xiàn),鉀離子通道蛋白基因過(guò)表達(dá)植株在鹽脅迫下始終表現(xiàn)出生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。Nie[20]研究發(fā)現(xiàn),RPM1抗病蛋白在白粉病病原體感染的先天免疫機(jī)制中起重要作用。綜上所述,本試驗(yàn)關(guān)聯(lián)到的32個(gè)與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的基因,對(duì)水稻的生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響,為今后稻米品質(zhì)改良提供參考信息。