釀酒酵母抗氧化活性與發酵香氣化合物研究

楊學山 李潔春 楊 柳 李俊娥 祝 霞

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院,蘭州 730070; 2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室,蘭州 730070)

0 引言

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae,S.cerevisiae)在酒精發酵過程中代謝產生的高級醇、酯、醛、酸等化合物,是塑造葡萄酒香氣風格與典型性的關鍵因子[1-2]。但在葡萄酒釀造過程中,發酵菌株會受到高糖、低pH值、乙醇、氧化脅迫等因素的影響,導致細胞內的抗氧化防御系統失衡,產生活性氧(Reactive oxygen species,ROS),破壞細胞脂質、蛋白質和DNA等細胞成分,抑制菌株的生長和發酵[3-4]。此外,ROS還會干擾輔助因子的平衡,改變或破壞靶分子結構,導致關鍵酶活力降低或喪失,影響發酵香氣物質的合成[5]。因此,提高發酵過程中釀酒酵母菌株的抗氧化能力,保持其較高的細胞活力對葡萄酒釀造具有重要意義。目前,國際葡萄與葡萄酒組織已批準酵母多糖作為發酵助劑應用于釀酒生產[6],加之使用綠色安全、便捷、可控和通用性較強,使其成為提升葡萄酒品質的研究熱點。

在葡萄酒實際釀造生產中,不同葡萄品種間的酶類和非酶類抗氧化成分組成相對復雜且差異較大。而人工配制的模擬葡萄汁成分明確,既可以滿足微生物生長的營養需求,又可以消除發酵體系中其他抗氧化成分對試驗結果的影響。為此,本文以模擬葡萄汁為試材,在酒精發酵前添加不同質量濃度的水溶性β-葡聚糖,探究其對酵母細胞的抗氧化活性和揮發性香氣化合物的影響規律,以期為深入解析水溶性β-葡聚糖對葡萄酒發酵香氣化合物的促進作用機制及其生產應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母菌株Aroma White,購自意大利Enartis公司。

水溶性β-葡聚糖SG 90,購于安琪酵母股份有限公司;糖鏈結構以β-1,3糖苷鍵為主,含有部分β-1,6糖苷鍵支鏈,純度85%以上,分子質量200～500 ku,具有良好的水溶性,推薦用量200～500 mg/L。

苯乙醇、正戊醇、正辛醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、乙酸己酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯等香氣標準品均購自美國Sigma公司。

SOD、ATP酶活力測定試劑盒,還原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、ROS、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒,購自南京建成生物工程研究所;L-蘋果酸、纖維二糖、肌醇、B族維生素、生物素等均為國產分析純,購自上海源葉生物科技有限公司;檸檬酸、硫酸鎂、硫酸錳、酒石酸氫鉀、偏重亞硫酸鈉等常規試劑均為國產分析純,購自天津光復化工研究所。

1.2 儀器與設備

TRACE1310-ISQ型氣相色譜-質譜儀,美國Thermo Scientific公司;DB-WAX型氣相色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),美國Agilent Technologies公司;固相微萃取頭,50/30 μm DVB/CAR-PDMS,上海安譜科學儀器有限公司;DK-S12型電熱恒溫水浴鍋,上海森信試驗儀器有限公司;PHS-3C型pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司;LRH-150型生化培養箱,上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1模擬葡萄汁體系構建

模擬葡萄汁的配制參考文獻[14]的方法。其中葡萄糖100 g/L、果糖100 g/L;磷酸氫二銨1 500 mg/L、磷酸二氫鉀750 mg/L、硫酸鉀500 mg/L、氯化鈣0.117 mg/L;肌醇20 mg/L、維生素B515 mg/L、維生素B10.25 mg/L、維生素B60.25 mg/L、生物素0.003 mg/L、維生素B32 mg/L;L-蘋果酸3.0 g/L、檸檬酸300 mg/L、酒石酸氫鉀2.5 g/L。模擬汁添加40 mg/L SO2(偏重亞硫酸鈉計),NaOH調節pH值至3.5。

1.3.2釀酒酵母菌株活化與模擬葡萄汁發酵

按產品說明書推薦方法對釀酒酵母菌株進行活化。將活性干酵母溶于10倍體積無菌水中,37℃靜置20 min,再加入等體積的模擬汁,28℃活化 25 min。根據課題組前期研究結果[15],將活化后的Aroma White菌株(0.2 g/L),接種于分別添加300、400、500 mg/L水溶性β-葡聚糖的模擬葡萄汁中,以未添加水溶性β-葡聚糖為對照(CK),20℃恒溫培養箱進行酒精發酵,殘糖質量濃度小于4 g/L時結束發酵。從接入釀酒酵母菌株(0 h)開始,每隔24 h測定酵母細胞的生物量(以600 nm波長處的吸光度(OD600)表征),繪制Aroma White菌株生長曲線。平行重復3次,結果取平均值。下同。

1.3.3釀酒酵母細胞抗氧化活性測定

1.3.3.1Aroma White細胞中ATP酶活力測定

分別在發酵的第2(初期)、3(中前期)、4(中期)、7天(末期)取樣(下同)。參照文獻[16]的方法并做修改,10 mL發酵樣液在3 500 r/min條件下離心10 min后傾倒上清液,收集酵母細胞;ATP酶活力測定不能引入磷,因此用5 mL 0.9% NaCl洗滌3次后,稱量,再次加入0.9% NaCl,冰水浴超聲破碎(4℃,功率360 W,開啟5 s,停止7 s,共計1 min),制成0.063 g/mL的勻漿。其余操作按照試劑盒說明書進行。

1.3.3.2Aroma White細胞中SOD酶活力測定

參照文獻[16]的方法并做修改,收集酵母細胞,準確稱取組織質量,用20倍體積的磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline,PBS)以1 000 r/min離心10 min洗滌酵母細胞,重復2次后,再加入20倍體積的0.9% NaCl,以3 500 r/min離心10 min,冰水浴條件下超聲破碎,制成10%的組織勻漿,將勻漿稀釋5倍,按照試劑盒說明書進行測定。

1.3.3.3Aroma White細胞中GSH含量測定

按照1.3.3.2節的方法,制成10%的細胞勻漿,按照南京建成試劑盒說明書進行測定。

1.3.3.4Aroma White細胞中ROS含量測定

取發酵樣液,3 500 r/min離心10 min收集細胞,PBS洗滌1～2次,將離心收集的細胞用PBS重懸,按照試劑盒說明書加入熒光探針(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA),按預試驗確定的濃度10 μmol/mL進行試驗。在最佳激發波長500 nm、最佳發射波長525 nm條件下進行熒光檢測。

1.3.3.5Aroma White細胞中MDA含量測定

按照1.3.3.2節的方法制成10%的細胞勻漿,參照MDA含量測定試劑盒說明書進行操作。

1.3.4揮發性香氣物質分析

參照文獻[17]的香氣物質萃取方法及GC-MS(氣相色譜-質譜聯用)條件,并略作修改。

1.3.4.1香氣成分富集

取8 mL待測酒樣,添加2.5 g NaCl、10 μL 2-辛醇(質量濃度為81.06 mg/L),放入恒溫加熱磁力攪拌器中,40℃水浴平衡30 min,插入萃取針(旋出萃取頭),頂空萃取30 min。

1.3.4.2GC-MS條件

GC條件:色譜柱DB-WAX 60 m×2.5 mm×0.25 μm,進樣口溫度240℃,傳輸線溫度230℃,離子源溫度250℃,不分流進樣;載氣(He)流速1 mL/min;進樣時間5 min;柱溫升溫程序:40℃保持5 min,以3.5℃/min升至180℃,保持15 min。

MS條件:電子轟擊離子源(EI);電子能量70 eV;傳輸線溫度180℃;離子源溫度200℃;質譜掃描范圍50～350 m/z。

定性定量分析:通過NIST-11、Wiley及香精香料譜庫對香氣化合物質譜圖進行初步檢索比對,并結合人工圖譜解析進行定性分析,確認各個香氣物質的化學成分。對已有標準品的高級醇、酯類和萜烯類等化合物,利用標準曲線(R2>0.995)定量,無標準品的化合物采用化學結構、官能團相似、碳原子數相近的標準物質進行半定量。

1.4 數據分析

測定均重復3次,取平均值,試驗數據用Microsoft Excel 2010 計算標準偏差,采用SPSS 19.0進行方差分析,用Duncan’s多重差異顯著分析;并用Origin 2018作圖。

2 結果與分析

2.1 水溶性β-葡聚糖對Aroma White菌株生長的影響

由圖1可知,在整個酒精發酵過程中,不同質量濃度的水溶性β-葡聚糖對Aroma White菌株生物量均具有明顯的促進作用。發酵3 d后,酵母細胞的生長趨于穩定;在發酵時間為第7天時,釀酒酵母細胞的OD600由大到小依次為300 mg/L(2.509)、400 mg/L(2.461)、500 mg/L(2.398)、CK(2.046)。與CK相比,分別提高22.63%、20.28%和17.20%。綜合分析,在模擬葡萄汁酒精發酵時添加水溶性β-葡聚糖有利于Aroma White菌株的生長,且添加量為300 mg/L時效果最佳。

圖1 水溶性β-葡聚糖對釀酒酵母生物量的影響

2.2 水溶性β-葡聚糖對Aroma White菌株抗氧化能力的影響

2.2.1ATP酶活力

ATP酶廣泛存在于細胞膜系統上,在能量轉換、物質運輸傳遞方面起著至關重要的作用,主要通過調節細胞內外滲透壓平衡和細胞膜結構與功能的完整性維持細胞正常的生理活性[18]。如圖2(不同小寫字母表示在P<0.05水平下組內差異顯著,下同)所示,受試組酵母細胞的ATP酶活力在中、后期顯著升高(P<0.05),在第4天時明顯高于對照組(P<0.05),分別比CK增加39.59%、36.43%和21.90%。不同質量濃度的水溶性β-葡聚糖處理組之間也存在差異,其中300 mg/L處理組在酒精發酵第7天時,ATP酶活力最高,比CK顯著增加57.04%;400 mg/L和500 mg/L處理組比CK分別提高37.24%和30.13%。

圖2 水溶性β-葡聚糖對釀酒酵母細胞中ATP酶活力的影響

2.2.2SOD酶活力

SOD酶作為酵母的主要抗氧化酶,能特異性地清除體內的氧自由基,SOD酶活力的變化能夠直接地反映酵母細胞對氧化脅迫應答的水平[19]。從圖3可知,在發酵的前期和中期,酵母細胞中的SOD酶活力增高。在發酵的第2天,300 mg/L和400 mg/L 水溶性β-葡聚糖處理組SOD酶活力分別比CK增加了24.85%和12.25%;酒精發酵第4天,300 mg/L處理組SOD酶活力最高,比CK提高22.43%。說明外源性添加水溶性β-葡聚糖能增加菌株SOD酶活力,從而提高細胞的抗氧化能力。

圖3 水溶性β-葡聚糖對釀酒酵母細胞中SOD酶活力的影響

2.2.3GSH含量

還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化性谷胱甘肽(Glutathione oxidized,GSSG)的氧化還原平衡對于調節細胞ROS水平至關重要,其中GSH可將部分巰基形成的二硫橋還原,防止含巰基的蛋白質與酶免受過氧化物的損害[20-22]。由圖4可知,各處理組細胞中GSH含量(質量比)在發酵過程中均高于CK(P<0.05),酒精發酵第7天,300 mg/L處理組的GSH含量最高,比CK提高76.50%,表明水溶性β-葡聚糖作為氧化刺激物,可以通過氧化應激來誘導提高GSH的合成代謝。綜上,在酒精發酵前添加水溶性β-葡聚糖可明顯促進酵母細胞中GSH的含量,且質量濃度為300 mg/L時效果最佳。

圖4 水溶性β-葡聚糖對釀酒酵母細胞中GSH含量的影響

2.2.4ROS含量

在正常的生理代謝活動中,適宜水平的ROS可作為細胞信號傳導、基因表達和調控動態氧化平衡的媒介。當細胞內ROS含量過高時,會攻擊DNA與蛋白質,并通過誘發過氧化作用影響細胞膜的流動性與穩定性[23]。圖5表明,在酒精發酵過程中,酵母細胞中的ROS含量逐漸降低(以熒光值表征細胞內ROS含量)。在發酵第2天時,處理組細胞中的ROS含量均顯著低于CK(P<0.05);第3天時,各組細胞中ROS含量由小到大依次為300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、CK,300 mg/L處理組較CK、400 mg/L和500 mg/L處理組分別降低44.14%、16.95%和21.20%;在第7天,各處理組中ROS含量無明顯差異,但與CK差異顯著(P<0.05)。

圖5 水溶性β-葡聚糖對釀酒酵母細胞中ROS含量的影響

2.2.5MDA含量

釀酒酵母細胞在發酵過程中可以產生氧自由基,攻擊生物膜的多不飽和脂肪酸,引起脂質過氧化作用。MDA是膜脂過氧化的主要產物之一,可作為評價其作用強弱的重要指標[20,22]。由圖6可知,酒精發酵前添加水溶性β-葡聚糖會降低釀酒酵母細胞內MDA含量。在發酵的第2天,處理組與CK不顯著,第3、4天,處理組的MDA含量均顯著低于CK(P<0.05)。其中第4天時,供試組MDA含量由小到大依次為300 mg/L組(1.49 mg/g)、500 mg/L組(2.17 mg/g)、400 mg/L組(2.74 mg/g)、CK組(4.22 mg/g),其中300 mg/L處理組較對照組顯著降低64.69%。由此表明,添加水溶性β-葡聚糖在酒精發酵(AF)前期和中期顯著減弱了膜脂過氧化反應,減弱了MDA對酵母細胞膜的損傷,且以添加質量濃度為300 mg/L時效果最佳。

圖6 水溶性β-葡聚糖對釀酒酵母細胞中MDA含量的影響

2.3 水溶性β-葡聚糖對揮發性香氣化合物的影響

外源性添加不同質量濃度的水溶性β-葡聚糖模擬汁發酵酒樣中的主要香氣物質GC-MS檢測結果如圖7(圖中星號表示處理組與CK或處理組之間差異顯著(P<0.05),ns表示處理組之間差異不顯著(P>0.05))所示。試驗共檢測出89種香氣化合物,其中酯類37種、高級醇類21種、酸類15種、萜烯類4種、其他類13種。

圖7 不同處理組酒樣的揮發性香氣物質

酯類物質對葡萄酒的花果香氣具有積極貢獻,主要包括乙酸酯、脂肪酸乙酯和其他酯類。本試驗共檢出4種乙酸酯,占酯類物質總量的9.42%～16.42%。各處理組之間乙酸酯類物質總量之間無顯著差異(P>0.05),但與CK相比,水溶性β-葡聚糖處理組的乙酸乙酯含量分別顯著增加19.84%、9.55%和31.32%(圖7a)。與CK相比,300 mg/L和400 mg/L處理組中脂肪酸乙酯含量分別顯著增加了47.32%和51.42%(圖7b)。各處理組中辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量最高,尤其是辛酸乙酯含量比CK分別提升45.39%、47.65%和51.42%。酯類物質總質量濃度由高到低為400 mg/L組(10 626.40 μg/L)、300 mg/L組(10 434.24 μg/L)、500 mg/L組(9 096.53 μg/L)、CK組(6 509.88 μg/L)(圖7d)。

在所有的發酵酒樣中,異戊醇的含量最高,約占高級醇類化合物含量的55%以上。其次是苯乙醇和異丁醇。300 mg/L和400 mg/L處理組之間的異戊醇含量沒有顯著差異,但顯著高于CK(P<0.05)(圖7e)。各試驗組共檢出14種酸類物質,質量濃度依次為913.91、1 120.29、1 187.56、1 214.85 μg/L(圖7f)。與對照組相比,300、400、500 mg/L處理組的辛酸含量分別提升28.88%、27.42%、29.94%,但均未超過感官閾值,對葡萄酒香氣不存在負面影響。處理組萜烯類物質比CK顯著增加,但是各處理組之間不存在顯著差異(P>0.05)(圖7g)。

參考文獻[1]的方法,選擇所有風味活性值(Odor activity value,OAV)大于0.1的發酵香氣成分進行主成分分析(Principal component analysis,PCA)。由圖8可知,PC1和PC2分別占數據總體方差的61.04%和25.45%,二者累計貢獻率為86.49%,可明顯區分水溶性β-葡聚糖處理組與CK酒樣。辛酸乙酯、辛酸、癸酸乙酯,花香、熱帶水果、脂肪味及300 mg/L和400 mg/L處理組酒樣主要分布在第一象限;己酸乙酯和500 mg/L處理組酒樣分布在第四象限,而CK酒樣分布在第三象限且無任何香氣成分分布。總體分析,水溶性β-葡聚糖處理有利于促進辛酸乙酯、癸醛、丁酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸、芳樟醇等香氣化合物的生成,酒樣的花香、熱帶水果和柑橘類香氣潛在特征較CK更加突出。

圖8 水溶性β-葡聚糖處理酒樣中香氣化合物及香氣特征的主成分分析

2.4 釀酒酵母細胞ATP酶活力及抗氧化能力與揮發性香氣化合物的相關性分析

將增香效果最突出的300 mg/L水溶性β-葡聚糖處理組中,OAV大于0.1的揮發性香氣化合物,分別與釀酒酵母細胞ATP酶活力及抗氧化能力進行Pearson相關性分析。結果表明(圖9),辛酸乙酯質量濃度與ATP酶活力存在強正相關性(r=0.92),與ROS質量濃度和MDA含量存在強負相關(r<-0.9)。辛酸乙酯質量濃度與SOD酶活力和GSH含量均存在較強正相關性(r>0.8),辛酸、辛酸乙酯、芳樟醇質量濃度與ROS含量和MDA含量存在較強的負相關性(r<-0.8),乙酸異戊酯質量濃度與MDA和ROS含量存在正相關性(r>0.6),這可能與釀酒酵母細胞合成分泌的酯酶對不同酯類底物的水解平衡有密切關系。

圖9 釀酒酵母細胞抗氧化能力與揮發性香氣化合物的相關性熱圖

3 討論

文獻[18]發現細胞對大部分的外界脅迫反應都集中在線粒體,尤其是在電子傳遞鏈(Electron-transport chain,ETC)上。外界的脅迫使酵母細胞的ATP需求增加,當線粒體無法產生足夠的ATP支撐細胞抵抗脅迫時,就會影響到細胞增殖。本試驗結果表明,外源性添加水溶性β-葡聚糖可以顯著增加釀酒酵母ATP酶活力,以利于增強線粒體功能來提高細胞對多種脅迫的耐受性。GSH可使細胞內巰基酶的活性基團維持還原狀態,保證了抗氧化酶發揮生理功能[21];同時GSH自身也可夠清除ROS自由基,延遲細胞凋亡[24]。本試驗中,水溶性β-葡聚糖能顯著提高釀酒酵母細胞中SOD和GSH活性(P<0.05),降低MDA水平,且與其抗氧化能力之間存在一定劑量-效應關系。其中300 mg/L水溶性β-葡聚糖處理組中抗氧化酶活力較高,尤其是發酵中、末期,GSH對細胞維持較高水平的抗氧化能力具有積極作用,從而使發酵菌株保持較高的生物量,有利于合成和分泌更多的揮發性香氣化合物。

本試驗進一步證實,添加300 mg/L的水溶性β-葡聚糖后,模擬汁發酵酒樣中的乙酸酯、脂肪酸乙酯類和高級醇的含量顯著增加(P<0.05)。究其原因,可能與水溶性β-葡聚糖提高了ATP酶的活力有關[25]。活力顯著增高的ATP酶可催化產生更多的ATP參與脂肪酸活化,并促進酯化反應的進行,提高了酒樣中己酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等中鏈脂肪酸乙酯的含量。水溶性β-葡聚糖處理組中高級醇含量顯著高于對照組(P<0.05),也可能與S.cerevisiae中ATP酶活力增強,分解更多的ATP有利于為Ehrlich途徑提供能量[26]。此外,模擬汁發酵酒樣也檢測到了微量的萜烯類化合物,300 mg/L 處理組中萜烯類化合物含量較對照組增加80.10%,這與發酵過程酵母中的ROS降低,減少了萜烯類等香氣物質的氧化降解作用直接相關[27],也與文獻[28]研究證明GSH可以降低某些重要的酯類、萜烯類等香氣化合物的氧化損失結果一致。

相關性熱圖分析結果表明,300 mg/L水溶性β-葡聚糖處理對苯乙醇、正辛醇的生成促進作用最為明顯,表明水溶性β-葡聚糖處理有利于促進酵母細胞的Harris代謝途徑,提升酒樣的醇香和花香。脂肪酸參與酯類物質生成,是合成酯類風味化合物不可或缺的前體物質,其含量對于水果香氣特征的感知至關重要[29]。水溶性β-葡聚糖處理組的辛酸含量較對照組均有增加,同時引起了辛酸乙酯含量較對照組均顯著增加。其中300 mg/L處理組辛酸乙酯含量增加最為明顯,推測可能是水溶性β-葡聚糖促進了酵母脂肪酸的代謝,進一步轉化生成了脂肪酸乙酯,這與文獻[30]的研究結果類似。但抗氧化活性與其他酯類化合物的轉化水解平衡,尤其對酯酶活力的調控關系需要進一步探討。

4 結束語

在模擬葡萄汁中外源性添加水溶性β-葡聚糖,能夠促進酒精發酵過程中酵母細胞的生長,有效降低細胞內ROS的積累,使ATP酶活力、SOD酶活力和GSH含量保持相對較高的水平,抑制MDA的生成,具有良好的抗氧化能力。同時,300 mg/L水溶性β-葡聚糖還可以明顯提高模擬葡萄汁發酵酒樣中酯類、高級醇類物質的含量,且與釀酒酵母細胞的抗氧化能力呈高度正相關。綜合分析,外源性添加300 mg/L水溶性β-葡聚糖,可以促進釀酒酵母的生長、提高細胞抗氧化水平,增強發酵香氣化合物的合成,具有應用在葡萄酒/果酒增香釀造的潛力。