不同熱解溫度骨炭孔隙結構的Micro-CT原位三維可視化表征

朱 瀛 王夢妍 黃圓萍 解茹越 劉 賢 韓魯佳

(中國農業大學工學院,北京 100083)

0 引言

動物源骨粉是畜禽屠宰加工行業的主要副產物之一。隨著畜禽養殖及其加工業的不斷發展,每年動物源骨粉產出量不斷增加,但是動物源骨粉直接堆棄的低效處理往往會對土壤和水體等環境造成污染,從而危害人類和動物的健康安全[1]。因此,其資源化、高值化利用尤為重要[2]。骨炭是動物源骨粉高溫熱解的產物,用作活性催化劑載體或是水體和土壤的吸附劑,在吸附重金屬[3-4]、染料和抗生素[5]等方面均呈現出較好的資源高值化利用潛力。

骨炭豐富的微觀形貌結構特征,比表面積、孔隙率和孔徑分布等,與其吸附性能息息相關。常用的微觀形貌結構表征方法主要有基于組織結構特征的電子顯微鏡觀察法和氮氣脫吸附法(Brunauer,Emmett &Teller,BET)[6]。經典電子顯微鏡法是應用最為普遍的低成本和低應用閾值的形貌特征可視化分析方法,但分析過程中需要對樣品進行復雜破壞性前處理,且穿透性較差;BET分析方法雖可獲取樣品的比表面積、孔徑分布值和孔隙率等微觀孔隙結構參數,但無法實現可視化表征。因此,研究開發用于表征微觀孔隙結構表征的非破壞性原位、三維、可視化新方法,一直是各國科學家高度關注的熱點方向[7]。

顯微X射線計算機斷層成像(Micro-computed tomography,Micro-CT)是一種先進的快速、無損、高分辨率(幾微米)顯微原位三維斷層成像分析技術。Micro-CT的分析原理是樣品各位點對X射線的衰減不同產生對應的灰度圖像,基于相應的圖像處理算法獲得樣品的斷層圖像和三維結構圖[8-9]。Micro-CT方法具有快速、無損和原位檢測等特點,在醫學[10-11]、農業[12-13]、食品[14-15]和土壤環境[16-17]等領域已有一定的研究基礎,特別是其在骨骼[18]和生物炭[19-20]方面的研究對于本研究具有一定的參考價值。理論而言,骨炭中的骨基體與骨孔隙的密度存在差異,其X射線衰減程度不同,而Micro-CT具有辨識特定對象局部密度差異的性能優勢,利用Micro-CT可以獲取其孔隙結構特征。然而,骨炭特異的組織結構導致其成像信息復雜,需要經特定圖像處理才能較準確地獲得其微觀孔隙結構特征。

鑒于此,本文以豬源和牛源骨粉為原料制備不同熱解溫度骨炭,在研究比較特定圖像處理方法的Micro-CT圖像處理效果的基礎上,提出優化的骨炭Micro-CT圖像處理算法,并據此進行不同骨炭微觀孔隙結構的定性和定量表征,以期為相關研究提供一種新的原位、三維可視化表征手段。

1 材料與方法

1.1 不同動物源骨炭制備

本研究所使用的牛骨與豬骨粉原料均來自于中國農業大學生物質資源利用工程實驗室飼料樣品庫。牛骨與豬骨粉原料均密封置于4℃恒溫冷藏柜保存。

骨炭樣品通過熱解方法制備。熱解過程的主要參數為:熱解溫度分別設定為400、500、600、700、800℃,升溫速率10℃/min,保持時間1 h,N2流速100 mL/min[21]。所有骨顆粒樣品均過0.5 mm篩。研究中隨機選取不同熱解溫度的豬骨炭(pc)和牛骨炭(bc)顆粒各3個,作為電鏡觀察樣品集;再隨機選取不同熱解溫度的豬骨炭和牛骨炭顆粒各3個,作為Micro-CT定性和定量表征的樣品集。

1.2 基于Micro-CT的骨炭孔隙結構定性和定量表征方法

1.2.1Micro-CT掃描及圖像重建

本研究使用Skyscan 1275型Micro-CT系統(Bruker Skyscan公司,比利時)對樣品進行掃描,主要掃描參數為:管電壓50 kV、管電流200 mA、圖像分辨率10 μm、曝光時間40 ms、360°掃描且旋轉步長0.2°、掃描時間40 min。每個顆粒采集80個投影圖像。

采用Bruker NRecon軟件進行樣品圖像重建,獲得Micro-CT三維容積圖像。主要重建參數為:圖像平滑系數為1、環形偽影矯正系數為3、射線硬化矯正系數為40%、圖像重建X射線吸收系數區間為0～0.12。

1.2.2Micro-CT重建圖像濾波處理

為提高Micro-CT重建圖像的精度,采用不同濾波算法對重建后的Micro-CT原始圖像進行優化處理,以期凸顯骨炭孔隙結構的同時保證骨炭基體邊緣結構的完整性,以利于后續圖像分割處理,并提高孔隙結構數據的準確性。

非銳化濾波(Unsharp mask,UM)是一種銳化圖像的算法[22-23]。該算法主要通過強化圖像的高頻內容,增強圖像中的邊緣和細節信息,從而顯著改善圖像的視覺外觀。經預研優化,Radius值設置為5,Amount值設置為90%,Threshold值設置為0。

自適應對比度增強濾波(Adaptive contrast enhancement,ACE)主要用于圖像對比度增強[24-25]。該算法通過分析圖像局部區域內各像素點的灰度差異做出自適應處理,使圖像中灰度較高的區域進一步升高,而灰度偏低的區域進一步降低。

為了進一步比較優化不同濾波處理的圖像處理效果,本研究還使用了UM和ACE聯合濾波處理,即UM&ACE濾波處理方法。

研究中,UM算法基于Bruker CTAn軟件中Unsharp Mask函數進行計算,ACE算法基于Matlab中的histeq函數進行計算,UM&ACE則為先進行UM計算然后再進行ACE計算。

1.2.3Micro-CT圖像二值化方法

不同熱解溫度的骨炭顆粒Micro-CT圖像二值化分割方法主要基于Bruker CTAn軟件中的全局自適應閾值分割(Otsu)函數和局部自適應平均閾值(Adaptive mean-C)函數,其中采用Otsu閾值分割方法獲取骨炭顆粒的邊緣圖像,進而提取出骨炭顆粒Micro-CT圖像的感興趣區域(Region of interest,ROI),采用Adaptive mean-C閾值分割方法對ROI區域內的Micro-CT圖像進行二值化處理,獲取骨炭顆粒內部的孔隙結構。上述兩種閾值分割方法的具體描述如下:Otsu方法是依據骨炭顆粒Micro-CT圖像整體的灰度直方圖做出聚類分析,由于骨炭顆粒基體與圖像背景的灰度差異較大,因此在分類計算中能夠準確地分割出骨炭顆粒的邊緣以獲取圖像的ROI區域。Adaptive mean-C方法則是通過不斷統計分析圖像中某一固定大小的區域內各像素點的灰度與區域內整體像素點的平均值之間的差異進行圖像分割,其分割效果主要取決于調整窗口寬度(WS)和修正值(C),本研究參考前期研究的結果,將WS值設定為5,C值設定為0后進行閾值分割[26]。

1.2.4骨炭顆粒顯微結構原位三維可視化呈現

使用Bruker CTVox軟件對經濾波和二值化處理后的不同熱解溫度的骨炭顆粒圖像進行三維可視化呈現,每個溫度梯度均包含3個骨炭顆粒樣品作為平行對照。經二值化處理后的Micro-CT圖像轉化為骨炭基體、骨炭孔隙和背景3部分,其中骨基體高密度區域渲染為白色,孔隙和背景以黑色呈現。從每個三維渲染容積圖像中分別選取第20、40、60幅斷層切片用于內部結構展示。

1.2.5骨炭顆粒孔隙結構相關參數的定量計算

使用Bruker CTAn中3D Analysis模塊計算樣品表面積S,比表面積計算公式為

(1)

式中m——預先稱量的樣品質量

以ROI為計算區域,使用Bruker CTAn軟件分別計算出骨炭基體和骨炭孔隙的體積。骨炭顆粒孔隙率計算公式為

(2)

式中P——孔隙率

Vp——骨炭孔隙體積

VT——骨炭基體體積

使用Bruker CTAn中3D Analysis模塊計算樣品孔徑分布,該模塊對某一完整孔隙的量化方法如下:首先,基于骨炭顆粒Micro-CT圖像二值化后的結果在三維空間內找到一個完整的孔隙結構。然后,模擬產生一個形狀規則的球體填入骨炭孔隙結構中。最后,不斷調整該球體的直徑直到滿足球體完整地嵌入在孔隙結構中且球體的直徑達到最大值的條件,此時將該球體的直徑定義為此孔隙結構的孔徑。

基于上述模塊計算出的孔徑分布結果,可將骨炭的孔徑分布由以下幾個主要參數進行量化表征:S10、S50、S90和Sspan,其中S10、S50、S90分別表示樣品累計孔徑分布達到10%、50%、90%時所對應的孔徑分布值,而Sspan是對孔徑分布相對寬度的度量[27],其計算公式為

(3)

1.3 樣品實驗室常規分析

1.3.1掃描電鏡觀察

使用SU3500型掃描電鏡(Hitachi公司,日本)觀察骨炭樣品表面微觀結構。工作參數為:使用磁控管濺射金屬鍍膜裝置(MSP-mini,IXRF Systems,日本)噴金30 s,工作電壓為15 kV,工作距離為5 mm,圖像放大倍數為500倍。

1.3.2比表面積測定

使用ASAP 2460型物理吸附儀(Micromeritics公司)對不同熱解溫度下的骨炭樣品的比表面積進行測定,所有樣品均在200℃的條件下真空脫氣5 h,并在相對壓力為10-6～0.995的范圍內測定氮氣吸附特性。基于氮氣吸附等溫曲線通過Barret-Joyner-Hallendy(BJH)法擬合計算得出樣品的比表面積。

1.4 數據統計分析

文中表格數據均表示為3次重復平均值±標準偏差。采用IBM SPSS V20軟件中的Duncan法進行多重比較檢驗。

2 結果與討論

2.1 骨炭Micro-CT圖像不同濾波處理效果比較

豬骨炭和牛骨炭Micro-CT重建圖像的不同濾波處理效果如圖1所示,所有Micro-CT圖像均以中間斷層示出,白色為顆粒骨基體高密度區,黑色為孔隙和背景;從左至右各列依次為顆粒電鏡圖像、原始灰度圖、UM濾波、ACE濾波和UM&ACE濾波處理的斷層圖像。由圖1可以看出,Micro-CT原始圖像未能呈現明顯的骨炭顆粒孔隙結構,個別密度較低的區域呈現類似孔隙特征但其灰度又遠高于背景的灰度,從而無法直接判定為孔隙并由此帶來誤差。采用ACE濾波方法處理后的Micro-CT圖像孔隙結構明顯,表明該方法增強了Micro-CT圖像中各像素點間的灰度對比度,然而進一步觀察ACE處理后骨炭Micro-CT圖像可發現,骨炭顆粒邊緣存在明顯的缺失,這與骨炭電鏡觀察結果不一致。電鏡圖像顯示,豬骨炭和牛骨炭顆粒表面并無明顯的缺陷和大孔。采用UM圖像濾波方法處理后的骨炭Micro-CT圖像顆粒邊緣的灰度顯著提高,同時骨炭顆粒內部區域的灰度并無明顯的變化。而經UM&ACE處理的骨炭顆粒Micro-CT圖像,既有效提高了骨炭內部孔隙結構與骨炭基體間的對比度,又保證了骨炭顆粒邊緣信息的完整性。由圖1還可以看出,采用Adaptive mean-C方法能夠較好地對UM&ACE濾波處理后的骨炭顆粒Micro-CT圖像進行二值化處理。因此,骨炭顆粒Micro-CT圖像優化濾波處理方法以UM&ACE為最優。

圖1 不同骨炭顆粒樣品Micro-CT重建圖像的濾波處理效果比較

2.2 骨炭微觀孔隙結構的Micro-CT原位三維可視化表征

不同熱解溫度下的豬骨炭和牛骨炭Micro-CT原位三維可視化表征結果如圖2所示,圖中白色為骨炭基體高密度區、黑色為孔隙和背景。由豬、牛骨炭Micro-CT三維容積模型結果可以看出,豬、牛骨炭顆粒的表面并無明顯的孔隙結構,其顆粒表面的形貌與圖1中各熱解溫度下的豬、牛骨炭電鏡圖像相近。而由圖2中豬、牛骨炭顆粒的Micro-CT斷層圖像可知,豬、牛骨炭內部具有豐富的孔隙結構,其形貌多呈橢圓形,這與豬、牛骨顆粒為熱解的孔隙結構特征相近。上述結果表明,基于Micro-CT和圖像分割技術的豬、牛骨炭三維斷層結構表征具有一定的可行性,其不僅表征了骨炭的整體三維結構,更呈現出了骨炭顆粒內部的豐富孔隙結構,這為骨炭孔隙結構的表征提供了一種新的思路,并且有利于進一步分析量化不同熱解溫度骨炭顆粒的孔隙結構。

2.3 骨炭微觀孔隙結構參數的Micro-CT量化表征結果

2.3.1比表面積定量表征結果

不同熱解溫度骨炭顆粒比表面積的Micro-CT 量化表征結果如表1所示。

表1 豬、牛骨炭不同濾波處理Micro-CT圖像比表面積計算值

由表1結果可知,基于無濾波處理的骨炭顆粒Micro-CT原始圖像計算獲得的比表面積顯著低于基于BET法的測定值。由于顆粒內部的孔隙結構的豐富性與顆粒整體的比表面積正相關,可以認為這是無濾波處理組未能表征出骨炭顆粒內部的孔隙結構(圖2)所致。單獨采用UM或ACE濾波方法處理后的骨炭顆粒Micro-CT圖像比表面積計算值均較原始圖像的計算值有顯著提升,但與BET方法測定值仍有顯著的差異,這與圖2所示結果一致。ACE&UM方法處理后的基于Micro-CT圖像計算所得骨炭比表面積與BET測定值較為接近,其中500～700℃熱解溫度下的骨炭顆粒Micro-CT圖像計算值與BET測定值無顯著性差異,表明結合Micro-CT和圖像濾波處理技術進行骨炭孔隙結構的量化表征不僅具有較好的可行性,而且還可原位獲得骨炭三維空間結構的數據,這對于特定微觀形貌結構骨炭的定向制備具有指導作用。

由表1可以看出,熱解溫度為400℃時,豬骨炭和牛骨炭的比表面積最低;熱解溫度為 500～700℃時,隨著熱解溫度的升高,豬骨炭和牛骨炭的比表面積均有所下降,且以500℃時的比表面積最高,這一研究結果與已有同類研究結果較為一致[28]。對照掃描電鏡圖像(圖2)進一步分析,可能與高溫導致的部分孔隙結構坍塌有關。

2.3.2孔隙結構參數表征結果

不同熱解溫度骨炭顆粒孔隙率和孔徑分布的Micro-CT量化表征結果如表2所示。由表2可以看出,隨熱解溫度的升高豬、牛骨炭顆粒的孔隙率整體均呈先上升后下降的趨勢,這與之前所述的比表面積變化趨勢相一致。進一步觀察發現,隨著熱解溫度的升高,豬、牛骨炭顆粒的S10、S90、S50均呈現先上升后下降的趨勢而Sspan呈現先下降后上升的趨勢,這說明隨著熱解溫度的上升,豬、牛骨炭顆粒內部孔隙的孔徑整體呈先上升后下降的趨勢,這一研究結果與前人關于生物炭的研究結果相近[29]。

表2 豬、牛骨炭顆粒不同熱解溫度的孔隙率和孔徑分布統計

3 結束語

提出了一種基于Micro-CT和圖像處理技術的不同動物源骨炭顆粒原位三維可視化定性和定量表征方法。骨炭顆粒Micro-CT圖像濾波采用UM和ACE相結合的方法為最優,其中UM濾波主要參數為Radius值5、Amount值90%、Threshold值0,ACE濾波法采用自適應模型;圖像二值化方法為Adaptive mean-C。經對比驗證,基于Micro-CT的不同熱解溫度豬、牛骨炭顆粒基體與孔隙結構的定性表征結果及比表面積、孔隙率和孔徑分布等三維結構參數的定量表征結果均與傳統實驗室分析結果相吻合。研究結果為不同動物源骨炭顆粒微觀形貌和孔隙結構的分析提供了一種非破壞性原位三維可視化表征新手段。