劉永宇 ，夏敏，唐園慧，汪詩琪，駱志國

（1.錦州醫科大學十堰市太和醫院研究生培養基地，湖北 十堰 442000；2.湖北醫藥學院附屬醫院十堰市太和醫院 腫瘤防治中心，湖北 十堰 442000；3.武漢市人民醫院 腫瘤科，湖北 武漢 430000；4.湖北醫藥學院研究生院，湖北 十堰 442000；5.湖北醫藥學院附屬醫院十堰市太和醫院 腎內科，湖北 十堰 442000 ）

食管癌作為較常見的消化道腫瘤之一，其死亡率在所有腫瘤中排在第6 位，約90%病理類型為鱗狀細胞癌［1］，多數病人通過檢查發現病變往往已處于晚期階段，失去手術機會，遠期預后較差。放射治療在食管癌的綜合治療中扮演著重要的角色，能夠顯著減輕患者痛苦，提高生活質量［2］。盡管目前放療發展迅速，但放射抵抗往往使放療的效果不盡人意，容易導致局部腫瘤復發和治療失敗［3］。因此，迫切需要找尋食管癌放射抵抗的生物學標志物及提高放射敏感性的靶點。

糖基化是普遍的翻譯后修飾并深刻影響蛋白質的功能，參與體內的許多生物學過程［4］。已有研究認為異常糖基化既與腫瘤發生發展相關，又能促進癌細胞放射抵抗，例如：小細胞肺癌［5］、前列腺癌［6］和神經膠質瘤［7］等。α-1,6 巖藻糖基轉移酶（FUT8）可通過形成α-1,6 糖苷鍵將GDP巖藻糖轉移至N-糖鏈核心結構，組成核心巖藻糖［8］，有研究發現FUT8 參與調控多種腫瘤細胞功能［9］，但其對食管鱗狀細胞癌（ESCC）細胞的放射抵抗的影響尚不清楚。本研究通過生物信息學手段和細胞學實驗探討FUT8 與食管癌放療敏感性的關系，針對提高食管癌臨床放射治療效果提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

胎牛血清、1640 培養基，美國Gibco 公司；GADPH 抗體、FUT8 抗體、HRP-標記Ⅱ；美國Abcam 公司，FUT8 過表達及敲低序列，中國上海吉瑪公司；蛋白裂解液、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、細胞周期試劑盒、細胞凋亡試劑盒均，中國碧云天生物技術研究所；流式細胞儀，美國BD 公司；凝膠成像系統；美國Bio-Rad公司；人ESCC 細胞株KYSE，中國科學院上海細胞庫。

1.2 實驗方法

1.2.1 數據庫分析 Oncomine 數據庫（http：//www.oncomine.org/）設置的數據提取條件為：①“腫瘤類型：Esophagus Cancer”；②“基因：FUT8”；③“數據類型：mRNA”；④“分析類型：Cancervs.Normal Analysis”；⑤臨界值設定條件（P-value＜0.05,fold change＞1.5,gene rank=top10%），選擇柱狀圖為展示結果。GEPIA 數據庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/detail.php）在“表達”菜單中輸入“FUT8”，選擇“食管癌”進行數據分析。Strin 數據庫（www.string.or）設定的篩選條件如下：①“Protein Name：FUT8”；②“Organism：Homo sapiens”。

1.2.2 細胞培養 人ESCC 細胞株KYSE 購于中國科學院上海細胞庫，利用含10%胎牛血清的1640培養基進行培養，培養箱設置溫度37℃，CO2濃度5%，濕度95%，2～3 d 更換一次培養液，電子顯微鏡下觀察細胞貼壁生長至80%時，進行胰酶消化傳代。

1.2.3 穩定轉染細胞系的構建 采集生長狀態較好的KYSE 細胞，胰酶消化制備細胞懸液，接種在6 孔板上，細胞密度調整為2×105個/mL，根據Lipofectamine 3000 的操作指令，分別對表達組KYSE FUT8 及KYSE NC，敲低組KYSE shFUT8 及KYSE shNC 進行轉染，分別在轉染48 h、72 h 后用熒光顯微鏡觀察細胞發光情況，以便對生長和轉染效果進行評價，后在嘌呤霉素中繼續篩選1周，為開展后續試驗提供穩定轉染細胞株。

1.2.4 蛋白提取及Western blot 檢測 采集轉染后生長狀況良好KYSE 細胞，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）搖晃洗滌兩次，添加裂解緩沖液，置于冰上裂解30 min，離心機設置4℃、12 000 r/min、離心10 min 取上清液，用BCA 法測定每個樣品的蛋白含量。每種蛋白取50 μg 樣品，行10%SDSPAGE 電泳，儀器設置80 V 恒壓30 min，120 V 恒壓50 min，使蛋白轉移至PVDF 膜上，用脫脂奶粉配比封閉液，常溫條件下封閉2 h，按比例配一抗（FUT8 1∶1 500、GADPH 1∶1 000），加入一抗后在4℃的冰箱中冷藏1 晚，次日用TBST 緩沖液洗滌3 遍，每遍5 min，配比二抗羊抗兔IgGHRP（1∶1 000）、羊抗鼠IgG-HRP（1∶1 000），加入二抗后置于搖床，室溫孵育2 h，TBST 緩沖液洗滌3 遍，每遍5 min，ECL 上機曝光顯影。采用ImagePro Plus 6.0 圖像分析軟件得出灰度值，通過將內參蛋白與目的蛋白兩者灰度值相比得出目的蛋白的表達量，繪制柱狀圖。

1.2.5 克隆形成實驗 將生長狀態良好的KYSE細胞進行分組，以過表達的KYSE FUT8 細胞為實驗組，以NC 為陰性對照組；以敲低表達的KYSE shFUT8 細胞為實驗組，以shNC 為陰性對照組，各組細胞制備細胞懸液后，在電子顯微鏡下計數，每孔取適當數量在6 孔板中均勻接種，每組重復3個復孔，給予6 Gy 劑量的X 線對接種后的6 孔板進行照射，繼續培養兩周，細胞培養期間，需常觀察，培養完成后，取出各組6 孔板，棄去原培養基，PBS 搖晃洗滌2 次，自然晾干，4%多聚甲醇固定時間為15 min，棄去固定液，將0.1%結晶紫加入6 孔板，20 min 后回收結晶紫染料，洗凈自然晾干，對各孔存活細胞的數量進行鏡下統計并拍照記錄，將細胞存活數作為縱坐標，以照射劑量為橫坐標，繪制畫柱狀圖。

1.2.6 細胞凋亡實驗 將生長狀態良好的KYSE細胞進行分組，以過表達的KYSE FUT8 細胞為實驗組，以NC 為陰性對照組；以敲低的KYSE shFUT8 細胞為實驗組，以shNC 為陰性對照組，在顯微鏡下觀察，待細胞貼壁生長至80%，給予6 Gy 劑量的X 線照射，培養箱繼續培養48 h 后，取出培養瓶收集細胞，制備細胞懸液，依據細胞凋亡檢測試劑盒操作說明，依次采用Annexin V/PI雙染，流式細胞儀上機檢測細胞凋亡，得出各組細胞凋亡率，繪制柱狀圖。

1.2.7 細胞周期實驗 將生長狀態良好的KYSE細胞進行分組，以過表達的KYSE FUT8 細胞為實驗組，以NC 為陰性對照組；以敲低的KYSE shFUT8 細胞為實驗組，以shNC 為陰性對照組，在顯微鏡下觀察，待細胞貼壁生長至80%，給予6 Gy 劑量的X 線照射，培養箱繼續培養48 h 后，取出培養瓶收集細胞，制備細胞懸液，70%的冷乙醇固定，置于4℃冰箱過夜，次日棄去固定液，PBS 搖晃洗滌3 遍，依據細胞周期檢測試劑盒操作說明，加入配置好的工作液，采用流式細胞儀上機檢測細胞周期，Modfit4.1 得出各組G2/M 期細胞阻滯情況，繪制柱狀圖。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件包進行數據分析。計量資料以均數±標準差（）表示，采用配對樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FUT8 在臨床常見腫瘤中的表達

在Oncomine 數據庫，共收集到356 篇不同種類的研究成果。有52 項研究發現FUT8 表達差異有統計學意義，12 項研究表明FUT8 表達下降，表達增高有40 例（圖1A）。2005 年后，5 篇研究主要關注ESCC 及正常食管組織FUT8 的表達情況，共382 個樣本，文章分別發表于BMC Genomics，PLoS One，Cancer Res，Clin Cancer Res，Oncogene 等雜志。在上述5 項研究結果的中，FUT8 在ESCC 組織中較正常食管組織顯著高表達，中位數值排名為298.0，P=6.19e-4，表明其表達升高，并且差異有統計學意義（圖1B）。對其中Hu Esophagus 和Su Esophagus 的研究數據分析顯示：與正常組織相比，FUT8 在ESCC 組織中的表達明顯增高（P＜0.05，圖1C）。GEPIA 數據庫分析發現：FUT8 在食管癌中顯著高表達（P＜0.05，圖1D）。

圖1 生物信息學分析FUT8 在ESCC 組織中的表達

2.2 預測FUT8 基因在ESCC 中的變化及調控網絡

利用String 數據庫，以FUT8 為核心分析FUT8互作蛋白網絡（PPI），P＜1.94e-11，節點數為10個，在PPI 網絡中與FUT8 相互作用（P均＜0.05）的有 FUT6、MGAT2、MGAT4A、MGAT4B、MGAT4D、MGAT5、B4GALT1、B4GALT2、B4GALT3，涉及的主要生物學過程包括糖蛋白生物合成、蛋白折疊、免疫抵抗等，見圖2。

圖2 基于String 數據庫構建FUT8 相關蛋白網絡

2.3 FUT8 過表達及敲低細胞模型的構建

為了探索FUT8 對ESCC 細胞放射敏感性的調控作用，采用慢病毒感染技術將帶有熒光蛋白的FUT8 過表達質粒和配對的陰性對照組質粒轉染至ESCC 細胞KYSE 中，也將帶有熒光蛋白的敲低FUT8 表達的質粒及配對陰性對照組質粒轉染至ESCC 細胞KYSE 中，通過觀察鏡下熒光蛋白的表現，判斷轉染效果（圖3）。經嘌呤霉素篩選得到FUT8 穩定過表達及敲低的ESCC 細胞株。Western blot 驗證轉染后各組細胞FUT8 的表達差異。結果表明：在轉染了FUT8 過表達質粒的細胞株中，FUT8 的表達量顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05），在轉染了敲低FUT8 表達的質粒后，FUT8 的表達量顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 穩定細胞系FUT8 過表達及敲低水平蛋白印跡檢測

2.4 調節FUT8 對ESCC 細胞放射抵抗的影響

為了探索ESCC 細胞中FUT8 表達量與放射抗拒之間的關系，首先將FUT8 過表達及陰性對照組、敲低及陰性對照組KYSE 細胞依次給予0 Gy、6 Gy 劑量X 線照射，繼續培養48 h 后，通過流式細胞術和克隆形成試驗檢測FUT8 表達量的變化對細胞凋亡、細胞周期和克隆形成能力造成的影響。

給予6 Gy 劑量X 線照射后，KYSE NC 組、KYSE FUT8 組細胞調亡率分別為（3.12±1.32）%、（2.07±0.87）%，FUT8 過表達組ESCC 細胞的調亡率較陰性對照組顯著下降，差異有統計學意義（P=0.0007，圖 5A）；KYSE shNC 組、KYSE shFUT8 組細胞凋亡率分別為（17.71±1.63）%、（23.86±2.52）%，FUT8 敲低組ESCC 細胞的調亡率較陰性對照組顯著增高，差異有統計學意義（P=0.0054，圖5B）。

圖5 細胞凋亡實驗檢測FUT8 表達量的變化對ESCC 細胞放射敏感性的影響

A：過表達FUT8 的陰性質粒轉染至KYSE 細胞后鏡下熒光成像（20×）；B：過表達FUT8 的質粒轉染至KYSE 細胞后鏡下熒光成像（10×）；C：敲低FUT8表達的陰性質粒轉染至KYSE細胞后鏡下熒光成像（4×）；D：敲低FUT8表達的質粒轉染至KYSE細胞后鏡下熒光成像（10×）。

給予KYSE FUT8 組、KYSE NC 組細胞6 Gy劑量的X 線照射后，G2/M 期阻滯細胞占比情況分別是（34.29±0.47）%、（21.97±0.58）%，提示與對照組相比，FUT8 過表達組ESCC 細胞的G2/M期細胞比例顯著降低，差異有統計學意義（P=0.0004,圖6A）；而在KYSE shNC 組、KYSEshFUT8 組細胞中，G2/M 期阻滯細胞占比情況分別是（32.56±0.27）%、（41.61±2.97）%，提示與對照組相比，FUT8 敲低組ESCC 細胞的G2/M 期細胞比例顯著增加，差異有統計學意義（P=0.0004，圖6B）。

圖6 細胞周期實驗檢測FUT8 表達量的變化對ESCC 細胞放射敏感性的影響

KYSE FUT8 組、KYSE NC 組細胞經6 Gy 劑量的X 線照射后，繼續培養2 周，電子顯微鏡下計數克隆形成細胞數目分別是（43.12±1.74）、（25.05±1.52），對比陰性對照組，FUT8 過表達組ESCC 細胞的克隆形成細胞數顯著增高，差異有統計學意義（P=0.0005，圖7A）；KYSE shFUT8 組、KYSE shNC 組細胞中克隆形成細胞數目分別為（23.15±1.32）、（41.05±1.83），對比陰性對照組，FUT8 敲低組ESCC 細胞的克隆形成細胞數顯著下降，差異有統計學意義（P=0.0005，圖7B）。

圖7 克隆形成實驗檢測FUT8 表達量的變化對ESCC 細胞放射敏感性的影響

3 討論

放射治療作為食管癌綜合治療中的主要手段之一，治療效果會因瘤體對輻射的敏感性下降而不盡人意［10］。國內外對食管癌放射抵抗機制做出了大量研究，例如有環氧化酶［11］、信號轉錄激活因子3［12］、X 線修復交叉互補基因［13］等，均為解決食管癌放療相關臨床問題提供了幫助。

糖基化是普遍的翻譯后修飾的過程，且對蛋白質的功能有重要影響，研究表明，糖基化在腫瘤細胞的放射抵抗中能起到重要的調控作用，目前己被證實的分子有糖基轉移酶C1GALT1［14］、AGL3［15］、GnT-Vl［16］等。糖基轉移酶FUT8 可將GDP 巖藻糖轉移至N-糖鏈核心結構，從而構成核心巖藻糖，對糖蛋白加工修飾，并調控其生物功能。有學者發現，在甲狀腺乳頭狀癌中FUT8 的高表達與腫瘤的大小、轉移、分化程度有著必然聯系［17］；在胰腺癌中FUT8 高表達的腫瘤細胞中發現大量的巖藻糖基化的觸珠蛋白［18］；在直結腸癌研究中，FUT8 介導的核心巖藻糖基化能夠調節E-鈣黏蛋白狀態得到證實［19］。這些研究幫助筆者進一步了解了FUT8 在腫瘤細胞發展過程中的作用，但是對食管癌放射抵抗的影響尚不清楚。

為探索FUT8 對ESCC 細胞放射敏感性的影響。在本研究中，筆者通過體外實驗采用慢病毒轉染技術將ESCC 細胞KYSE 分別進行FUT8 的過表達和敲低，經X 射線處理后進行流式細胞術和克隆形成實驗。結果發現：FUT8 過表達組的ESCC 細胞凋亡率呈下降趨勢，阻滯在G2/M 期的細胞比例下降，克隆形成能力增強。而FUT8 敲低組的ESCC 細胞凋亡率呈上升趨勢，阻滯在G2/M期的細胞比例增高，克隆形成能力減弱。因此，筆者得出結論：FUT8 過表達可以降低ESCC 細胞放射敏感性，敲低FUT8 表達可以增強ESCC 細胞放射敏感性。

綜上所述，糖基轉移酶FUT8 參與調控ESCC細胞放射的產生過程，可能成為解決食管癌放射抗拒問題的潛在靶點。然而在本研究中僅在一種食管癌細胞系中得到驗證，下一步研究仍需在更多的細胞系中驗證并探究具體通路分子機制。