甲維鹽提純工藝優化研究

王鴻發，郭佳，李芳，王少云

(寧夏泰益欣生物科技股份有限公司，寧夏 銀川 750205)

0 引言

甲胺基阿維菌素苯甲酸鹽(簡稱“甲維鹽”)是以阿維菌素為初始原料進行合成的一種新型抗生素，其主要成分包括甲胺基阿維菌素苯甲酸鹽Bla 和Blb 的混合物。顏色為淡黃色、白色結晶粉末。易溶于丙酮、乙醇、甲醇等極性溶劑，微溶于水，水中溶解度(20 ℃，pH=7.0)0.024 g/L，(20 ℃，pH=3.0)0.003 g/L，不溶于己烷。在常溫常壓下，甲維鹽的穩定性較好，對熱不敏感，但在強酸、強堿、強光、強氧化劑的極端條件下不穩定。甲維鹽作為阿維菌素半合成衍生物，其結構與阿維菌素類似，但生物活性相比阿維菌素提高了1～3 個數量級。尤其是對鱗翅目害蟲、稻縱卷葉螟等活性極高。在蔬菜、水稻等大田農作物中應用更為廣泛，已有報道顯示，甲維鹽主要的殺蟲方式有胃毒和觸殺，即當生物體接觸該藥后，可通過滲透作用進入微生物體，發揮藥效，達到殺蟲的目的。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

YP4002 電子天平(上海越平科學儀器有限公司)；waters2487 型HPLC(江蘇塞恩斯科技有限公司)；HK-3C 型酸度計廠家為北京海富達科技有限公司，HS-DHG 電熱恒溫鼓風干燥箱(上海和晟儀器科技有限公司)；pH 計；溫度計。

1.2 試劑

甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、乙酸異戊酯、鹽酸等試劑均由天津市凱通化學試劑有限公司提供分析純試劑。

2 材料與方法

2.1 材料

甲維鹽粗品由寧夏泰益欣生物科技股份有限提供。

2.2 方法

2.2.1 實驗方法

溶解：精準稱量甲維鹽粗品適量，選用水、甲醇、乙醇、丙酮等溶劑進行溶解；

萃取：以甲維鹽粗品的溶解液進行實驗，篩選乙酸乙酯、石油醚、乙酸異丙酯等溶劑中最佳萃取劑，同時篩選萃取壓力、萃取時間和萃取溫度對甲維鹽純度和收率的影響；

分離：加入萃取劑的甲維鹽溶液經充分攪拌后靜置分層，篩選對甲維鹽收率和純度影響最小的分離壓力及分離溫度，分離所得萃取液；

結晶：將萃取液進行蒸發濃縮結晶，獲得甲維鹽成品。

2.2.2 檢測方法

采用單因素分析方法探究各因素對甲維鹽收率及含量的影響，并建立了HPLC 法測定甲維鹽的含量。色譜條件：WondaSil C18-WR 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為水-乙腈(3∶7)；流速1.0 mL/min，波長為280 nm。

3 結果與分析

3.1 溶解劑對甲維鹽純化的影響

甲維鹽在純化過程中需要先進行溶解，而不同溶劑對甲維鹽的溶解程度存在較大的影響。因此，在其他條件不變的情況下，考察水、甲醇、乙醇、丙酮等溶解劑的溶解效果，篩選最優溶解劑。具體結果如圖1所示。

圖1 溶解劑對甲維鹽收率和含量的影響

由圖1 可知，溶解劑中乙醇和丙酮對甲維鹽的收率和純度影響較大，其中丙酮作為溶解劑時，甲維鹽的收率和純度均為最大值，但由于丙酮揮發性強、具有堅強的毒性，對人體有害，而乙醇為常見試劑，對人體的危害較小，安全系數高，因此，可以選擇乙醇作為溶解劑。

3.2 萃取溶劑對甲維鹽純化的影響

萃取是采用一種溶劑將甲維鹽溶液中的甲維鹽溶解，分層并分離獲得甲維鹽萃取液，但是不同的萃取溶劑對甲維鹽的溶解效果存在較大的差異。篩選一種較好的萃取劑可以有效提升甲維鹽的純度。本次實驗篩選萃取劑為乙酸乙酯、乙酸異丙酯、石油醚。具體結果見圖2。由圖2 可知，本研究所用的三種萃取劑所得的甲維鹽的收率基本持平，但含量差異較大，乙酸乙酯的含量達到最大值，因此，以乙酸乙酯為萃取劑進行后續條件篩選的單因素實驗。

圖2 萃取劑對甲維鹽收率和含量的影響

3.3 萃取壓力對甲維鹽純化的影響

萃取過程中，壓力的變化能夠影響萃取的結果，也可以對甲維鹽成品結果產生影響，因此，稱取適量的甲維鹽粗品，共設8 個壓力梯度，分別為5 Pa、10 Pa、15 Pa、20 Pa、25 Pa、30 Pa、35 Pa、40 Pa，其余條件不變的情況下進行實驗。具體結果見圖3。

圖3 萃取壓力對甲維鹽收率和含量的影響

由圖3 可知，隨著萃取壓力的逐漸變大，甲維鹽純度和收率均為上升的趨勢，當萃取壓力小于30 Pa時，無論是甲維鹽的收率還是純度，都比較小，提純效果差；當萃取壓力增大到30 Pa 時，提純效果較佳，當萃取壓力在30～40 Pa 之間時，收率和純度的變化基本保持平穩，因此，萃取壓力可以確定為30～40 Pa。由于萃取壓力為30 Pa、35 Pa、40 Pa 時，提純效果幾乎沒有發生變化，如果從安全和經濟成本角度考慮，可以選擇低壓力30 Pa。

3.4 萃取溫度對甲維鹽純化的影響

稱取適量的甲維鹽粗品，加入乙醇溶解劑，用乙酸乙酯進行萃取，萃取壓力分別為30 Pa，萃取溫度分別設置為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50℃、55℃，其他條件不變的情況下進行單因素驗證實驗。具體結果見圖4。

圖4 萃取溫度對甲維鹽收率和含量的影響

由圖4 可知，萃取溫度對提純效果的影響小于萃取壓力。萃取溫度在40 ℃以下時，萃取效果較差；當溫度增大到40 ℃時，萃取效率明顯增大；當溫度增大到40 ℃時，萃取效果最佳，繼續增大溫度，收率和純度都逐漸減小，這可能是由于高溫對甲維鹽的結構造成了影響，導致小部分甲維鹽發生化學反應，生成其他物質。因此可以選擇40 ℃左右的萃取溫度。

3.5 萃取時間對甲維鹽純化的影響

在生產過程中，萃取時間的長短對純度、收率和產量均有直接影響，萃取時間短，可能會導致萃取不徹底，影響收率和純度，萃取過程消耗的時間長，可能造成時間的浪費，影響最終的進度和產量，因此稱取適量甲維鹽粗品，用乙醇溶解，加入乙酸乙酯萃取，萃取壓力為30 Pa，萃取溫度為40 ℃，設置7 個萃取時長進行驗證，分別為1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h。具體結果見圖5。

圖5 萃取時間對甲維鹽收率和含量的影響

由圖5 可知，萃取時長小于2.5 h 時，甲維鹽的收率和純度隨著萃取時間的延長而提高，增大幅度顯著；當萃取時長大于等于2.5 h 時，隨著萃取時間的延長，收率和純度基本趨于穩定，綜合各生產因素，萃取時間確定為2.5 h。

3.6 分離壓力對甲維鹽純化的影響

稱取適量的甲維鹽粗品，用乙醇溶解，加入乙酸乙酯萃取，萃取壓力分別為30 Pa，萃取溫度為40 ℃，共設置7 個分離壓力，分別為0.1 Pa、2 Pa、4 Pa、6 Pa、8 Pa、10 Pa、12 Pa，萃取時間為2.5 h，其余條件不變進行單因素實驗。具體結果見圖6。

圖6 分離壓力對甲維鹽收率和純度的影響

由圖6 可知，分離壓力為4 Pa 時，效果最佳，當分離壓力小于4 Pa，收率增大，甲維鹽純度下降，這可能是由于分離的樣品中含有一部分雜質；當分離壓力大于4 Pa 時，收率和純度都有所下降，這可能是流體中一部分甲維鹽沒有在分離釜中徹底分離。由于分離壓力對提純結果影響較小，因此在后續的正交試驗中分離壓力可以取4 Pa。

3.7 分離溫度對甲維鹽純化的影響

稱取適量的甲維鹽粗品，用乙醇進行溶解，加入乙酸乙酯萃取，萃取壓力為30 Pa，萃取溫度為40 ℃，分離壓力為4 Pa，萃取時間為2.5 h，分離溫度分別設置為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃進行驗證。具體實驗結果見圖7。

圖7 分離溫度對甲維鹽收率和純度的影響

由圖7 可知，在其他條件不變時，隨著溫度的提升甲維鹽的純度和收率呈先上升后下降的趨勢，當分離溫度在40 ℃時，甲維鹽的收率和純度達到峰值，依據最優值選擇，分離溫度確定為40 ℃。

3.8 工藝穩定性實驗

通過以上單因素實驗，確定了甲維鹽純化過程中的7 個參數，具體工藝參數如下：溶解劑為乙醇，萃取劑為乙酸乙酯，萃取壓力為30 Pa，萃取溫度為40 ℃，萃取時間為2.5 h，分離壓力為4 Pa，分離溫度為40 ℃。以所得最優工藝進行5 次重復實驗，驗證其工藝的穩定性。

由表1 可知，5 次平行試驗得到的甲維鹽平均收率在80.18%；甲維鹽B1 純度平均值為94.06%。5 次平行實驗的相對標準偏差分別為0.08%和0.11%，相對標準偏差均較低，表明該工藝合理可行。

表1 工藝穩定性驗證

4 結論

本研究通過對甲維鹽純化過程中的溶解劑、萃取劑、萃取壓力、萃取溫度、萃取時間、分離壓力和分離溫度等參數進行了優化，結果表明，每個單因素實驗中最適參數對甲維鹽收率、純度均有影響，通過此工藝穩定性驗證，甲維鹽純化后的收率達到80.18%，純度達到了94.06%。能夠萃取壓力為30 Pa，萃取溫度為40 ℃，分離壓力為4 Pa，分離溫度為40 ℃，萃取時間為2.5 h，其他參數若需要精確細化可繼續進行實驗。