依達拉奉對心肌重構小鼠AT1R/ StAR/ MR信號通路的影響

薛陽陽 秦窈窈 高建輝 岳鸞依 張瑋瑋 余淑珍

1.山西醫科大學麻醉學院，山西太原 030001；2.山西醫科大學第五臨床醫學院，山西太原 030001；3.山西醫科大學附屬省人民醫院麻醉科，山西太原 030012

心力衰竭死亡率快速上升，已成為嚴重威脅公眾生命的重大問題[1]。我國心力衰竭發病率逐年上升，臨床規范治療下5 年病死率達半數以上[2-3]。壓力超負荷致病理性心肌重構是心力衰竭獨立危險因素[4]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）是壓力超負荷致心肌重構的主要機制之一[5]。鹽皮質激素受體（mineralocorticoid receptors，MR）拮抗劑雖然可以特異性拮抗MR，治療心肌重構、緩解心力衰竭[6]，但有高鉀血癥、血肌酐升高、頭暈、疲乏、腹瀉等副作用[7]。因此，如何進一步針對性治療仍然面臨重要挑戰。依達拉奉具有抗凋亡、抗壞死、抗炎細胞因子和清除自由基的作用[8]。近年來研究表明，除神經系統外依達拉奉對心臟和血管同樣具有保護作用[9-11]。前期研究顯示依達拉奉治療大鼠心肌重構與調控血管緊張素Ⅱ1 型受體（angiotensinⅡtype 1 receptor，AT1R）/絲裂原活化蛋白激酶信號通路有關[12-14]。類固醇激素合成急性調節蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）是AT1R 發揮作用的中間蛋白，其易化膽固醇穿過線粒體外膜最終合成醛固酮從而激活MR。本研究旨在探究依達拉奉治療小鼠壓力超負荷致心肌重構形成是否與抑制AT1R/StAR/MR 激活有關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

本研究符合山西省人民醫院倫理委員會要求（2020 省醫科倫審字第140 號）。18 只4 周齡SPF 級C57 小鼠，體重22～24 g，購自山西省人民醫院實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（晉）2019-0001，使用許可證號：SYXK（晉）2019-0003。飼養于標準SPF級環境4 周，期間自由攝食、飲水。將小鼠按隨機數字表法分為3 組：對照組、血管緊張素Ⅱ組、依達拉奉組，每組6 只。

1.2 心臟壓力超負荷模型的建立

腹腔注射氯胺酮200 mg/kg 麻醉后，俯臥位置于操作臺上。參照文獻[15-16]，在肩胛間區下緣備皮消毒，2 cm 橫切口，用止血鉗皮下鈍性分離形成囊袋，血管緊張素Ⅱ組、依達拉奉組小鼠埋置預先充填血管緊張素Ⅱ的滲透泵，對照組小鼠埋置預先充填0.9%氯化鈉的滲透泵，然后用手術絲線縫合切口。

1.3 給藥方法

埋置滲透泵后，依達拉奉組給予依達拉奉腹腔注射（批號：2019031，吉林博大制藥有限公司）10 mg/（kg·d），連續28 d[13，15，17]。

1.4 稱重及取材

造模成功后，小鼠稱重并記錄。于異氟烷麻醉后，眼球采血后處死小鼠，剪下心臟，生理鹽水灌洗心腔，沖洗心腔內殘余血液后稱重并記錄，計算心重/體重（heart weight/body weight，HW/BW）比值。之后將其石蠟包埋。

1.5 心肌細胞橫截面積的測定

蘇木精-伊紅染色步驟：石蠟切片脫蠟，蘇木精染色，伊紅染色與脫水，乙醇和二甲苯透明，滴上中性樹膠，蓋上蓋玻片。每張切片由2 名工作人員隨機選取10 個有明顯細胞核和完整細胞膜的心肌細胞進行測定，Image J 軟件測量心肌細胞橫截面積（cross sectional area of myocardial cells，MSA）。

1.6 Masson’s 染色法測定膠原容積分數

石蠟切片常規脫蠟至水，依次在蘇木精染色液、麗春紅品紅染色液、磷鉬酸液、苯胺藍液、弱酸溶液沖洗后乙醇脫水、中性樹膠封固。每張切片由2 名工作人員隨機選取高倍鏡下的3 個視野，膠原容積分數（collagen volume fraction，CVF）＝藍色面積/總面積×100%。

1.7 免疫組織化學染色法測定心肌組織AT1R、StAR、轉化因子-β1（transforming growth factor，TGF-β1）、α-平滑肌肌動蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）、MR表達

石蠟切片常規脫蠟至水，抗原修復后，室溫孵育10 min，PBS 沖洗后，滴加一抗。AT1R 抗體（批號：BA0582，索萊寶生物科技有限公司，中國，1∶200）；StAR 抗體（批號：A16432，索萊寶生物科技有限公司，中國，1∶200），TGF-β1抗體（批號：BM3901，索萊寶生物科技有限公司，中國，1∶100）；α-SMA 抗體（批號：BM3902，索萊寶生物科技有限公司，中國，1∶50）；MR 抗體（批號：A3308，索萊寶生物科技有限公司，中國，1∶100），4℃過夜，次日PBS 沖洗，滴加二抗羊抗鼠抗體（批號：PV-9001，中杉金橋生物技術有限公司，中國）孵育30 min，PBS 沖洗，DBA 染色，蘇木精復染、封片。陽性染色為黃色或深褐色，每張切片2 名工作人員隨機選取高倍鏡下的3 個視野，切片掃描儀掃描后，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件測定累計光密度值和區域面積，計算平均光密度值。

1.8 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠HW/BW 比值、MSA 和CVF 比較

血管緊張素Ⅱ組小鼠HW/BW 比值、MSA 和CVF高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；依達拉奉組小鼠HW/BW 比值、MSA 和CVF 低于血管緊張素Ⅱ組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠HW/BW 比值、心肌細胞橫截面積和膠原容積分數比較（±s）

表1 各組小鼠HW/BW 比值、心肌細胞橫截面積和膠原容積分數比較（±s）

注 與對照組比較，aP＜0.05；與血管緊張素Ⅱ組比較，bP＜0.05。HW/BW：心重/體重比值；MSA：心肌細胞橫截面積；CVF：膠原容積分數。

2.2 各組小鼠TGF-β1、α-SMA、MR、StAR 和AT1R表達比較

血管緊張素Ⅱ組小鼠TGF-β1、α-SMA、MR、StAR、AT1R 蛋白表達高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；依達拉奉組小鼠的TGF-β1、α-SMA、MR、StAR、AT1R 蛋白表達低于血管緊張素Ⅱ組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠TGF-β1、α-SMA、MR、StAR 和AT1R 表達比較（±s）

表2 各組小鼠TGF-β1、α-SMA、MR、StAR 和AT1R 表達比較（±s）

注 與對照組比較，aP＜0.05；與血管緊張素Ⅱ組比較，bP＜0.05。TGF-β1：轉化生長因子-β1；α-SMA：α-平滑肌肌動蛋白；MR：鹽皮質激素受體；StAR：類固醇合成急性調節蛋白；AT1R：血管緊張素1 型受體。

3 討論

心肌重構是心臟應對壓力超負荷的代償機制，其特征表現為心臟質量增大、細胞肥大和相關蛋白增多[18]。長期壓力超負荷引起心肌舒張和收縮功能障礙最終導致心力衰竭[19]。目前治療心力衰竭的藥物有β 受體阻滯劑、血管緊張素轉化酶抑制劑和AT1R 阻滯劑，但心血管疾病病死率仍顯著增加[3]。因此，進一步了解心肌重構發生發展的生物學機制意義重大。本研究采用皮下埋置滲透泵持續灌注血管緊張素Ⅱ的方法復制小鼠壓力超負荷模型[16，20]。研究表明[21-22]，血管緊張素Ⅱ組小鼠HW/BW 比值、MSA、CVF 高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示小鼠心肌肥厚、膠原蛋白沉積增加、心臟纖維化形成進而心臟衰竭發生，結合本研究結果提示小鼠心肌重構模型制備成功。

小鼠埋置滲透泵后，血管緊張素Ⅱ與心肌和血管平滑肌上AT1R 結合，激活下游StAR 后易化膽固醇從線粒體外膜穿入，在細胞色素P450 側鏈裂解酶作用下轉化為孕烯酮，接著生成脫氧皮質酮最終合成醛固酮，醛固酮與MR 結合后使其轉位到細胞核發揮促高血壓、心肌重構和炎癥作用[23-25]。血管緊張素Ⅱ和醛固酮又介導炎癥細胞如單核細胞、巨噬細胞在心臟組織內增殖，從血管遷移到組織間隙，大量巨噬細胞產生TGF-β，促使心臟成纖維細胞分化為生成α-SMA的肌成纖維細胞，后者生成細胞外基質如膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ的能力是成纖維細胞數倍，從而導致細胞外基質過度堆積，心肌重構加重[26-27]。

本研究結果顯示，血管緊張素Ⅱ組小鼠的HW/BW比值、MSA 和CVF 高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示依達拉奉可抑制小鼠壓力超負荷致心肌重構。血管緊張素Ⅱ組小鼠心肌細胞的AT1R、StAR和MR 蛋白表達高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；依達拉奉組小鼠心肌細胞的AT1R、StAR 和MR 蛋白表達低于血管緊張素Ⅱ組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示依達拉奉治療小鼠壓力超負荷致心肌重構與抑制AT1R/StAR/MR 有關。李開智等[28]研究表明，依達拉奉通過調控PI3K/Akt 信號通路改善大鼠心臟功能，與本研究結果一致，但目前缺乏依達拉奉抑制AT1R/StAR/MR 信號通路的相關報道，這是此研究的創新點。

鑒于治療心力衰竭沒有確切的有效方法，本研究有望為該藥的臨床推廣提供重要理論依據，可以與β 受體阻滯劑、血管緊張素轉化酶抑制劑或AT1R 阻滯劑聯合用于心力衰竭患者的治療，以防止心功能障礙的進展。目前缺乏依達拉奉治療心肌重構的最佳劑量數據，此外其潛在機制有待完全闡明，這是未來探索的方向。

綜上所述，依達拉奉可抑制小鼠壓力超負荷致心肌重構形成，其機制與抑制AT1R/StAR/MR 信號通路激活有關。