浙江省金華地區人群PTPN22-1123GC多態性在類風濕關節炎易感性中的意義

胡益飛 張麗英 盧麗華

1 浙江大學醫學院附屬金華醫院檢驗科,浙江省金華市 321000; 2 金華市文榮醫院檢驗科

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以慢性進行性關節病變為主的自身免疫性疾病,該病多見于中老年女性群體,男∶女的發病率為1∶(2～3)[1]。近年來,隨著對RA發病機制的深入研究,不少研究者表示RA的發病與遺傳因素有關,且在孿生子弟患病率和家系調查中發現,遺傳因素在RA易感性中所占據的比重大約為60%,其中酪氨酸磷酸酶非受體型22蛋白(PTPN22)作用最為關鍵[2]。PTPN22是組織相容性復合物以外與自身免疫性疾病密切相關的最強風險因素之一。近年來,國內大量研究報道指出PTPN22-1123GC與系統性紅斑狼瘡疾病的發生發展密切相關,這使得學界開始關注起PTPN22-1123GC與RA易感性之間的關聯性[3],但現有研究成果并無關于浙江省金華地區人群的研究報道,其是否與浙江省金華地區人群相符合是我地區RA研究的重要熱點。我課題組選取浙江大學醫學院附屬金華醫院接診的RA患者選取50例作為病例組,同期健康體檢人群中選取20例健康人員作為對照組,對其PTPN22-1123GC基因多態性進行檢測,具體情況報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 自浙江大學醫學院附屬金華醫院2020年1—5月接診的RA患者中選取50例作為病例組,其中女35例,男15例,年齡27～68歲,平均年齡(48.62±10.87)歲。另從同期健康體檢人群中選取20例健康人員作為對照組,其中女14例,男6例,年齡25～66歲,平均年齡(48.15±10.42)歲。兩組對象性別、年齡比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。入組對象均經過倫理委員會批準同意,且獲得了患者或家屬的同意。

1.2 選擇標準 (1)納入標準:根據美國風濕學會在1987年制定的診斷標準確診,即每日晨僵持續時間達到了1h以上,病程至少有6周;表現出掌指、腕關節、近指關節腫脹特點,病程至少有6周;表現出三個或者三個以上關節腫脹,病程至少為6周;檢查發現有皮下結節;表現出對稱性關節腫脹,病程至少有6周;手X線有明顯改變,至少表現出關節間隙與骨質疏松狹窄;類風濕性因子呈現陽性。滿足上述7個條件中的任意4項。且為浙江省金華地區本地人員;知情同意。(2)排除標準:合并有肝、腎、心、肺等嚴重臟器功能障礙性疾病以及其他自身免疫性疾病。

1.3 方法

1.3.1 血標本采集:每例入組對象各取2.0ml靜脈血,將其置于2% EDTA抗凝管內,并放置于冰箱內保存備用,以便后續檢測需求。

1.3.2 全血中基因組DNA的提取:將抗凝管血樣轉移到離心管內,向其中加入10×TE 2.0ml,充分震蕩,并放置于離心機上進行10min離心處理,拋棄上清液后,再次加入2～3ml 10×TE,再次充分震蕩,再次進行10min離心處理。重復完成上述步驟2～5次,觀察紅細胞沉淀情況,若發現其沉淀明顯發白即可。將沉淀物加入1ml Lysis buffer中,隨后繼續加入蛋白酶K液,放置于37℃的條件進行裂解處理。在每管中分別加入飽和酚1ml,持續進行5min離心處理,將上清液轉移到干凈離心管內,再次加入相同體積的酚,再次實施5min離心處理,根據結果還可反復實施,直至獲得滿意效果。取上清液后,向其中加入氯仿:異戊醇(比例24∶1),對其進行5min離心處理。繼續加入1/10體積NaOAc(3M)和冰無水乙醇,將其放置于-20℃的條件沉淀。取出后放置于4℃條件下持續進行20min離心處理,繼續給予70%乙醇溶解沉淀,按照上述方法繼續離心處理,隨后加入1×TE進行溶解。

1.3.3 DNA的定量與質量鑒定:以高壓去離子水來作為本次研究的空白對照。取DNA母液5μl,向其中加入去離子水直至刻度500μl,充分混合后將其及時轉移到比色杯內。對照與樣品分別放置于分光光度計中,取260nm、280nm光度時核酸濃度。若兩個波長的結果在1.6～1.8,即表示有較高純度。將獲取的DNA樣品,以0.1×TE充分稀釋到100ng/ml之后,將其放置于-20℃條件下保存。

1.3.4 PCR(聚合酶鏈反應)擴增:經由NCBI對IL-10基因序列進行查詢,并基于查詢結果完成序列引物設計,配合Premier5.0軟件確定PTPN22-1123G/C位點引物。本次擴增方法主要根據試劑盒說明書要求完成操作。

1.3.5 電泳鑒定:對上述PCR產物進行抽取,并將其液樣充分混合,通過2.0%瓊脂糖實施凝膠電泳處理,作用時間設定為25min,電壓設定為120V。在凝膠成像儀下觀察電泳結果,并在紫外光下對PCR擴增后DNA大小進行檢查。PCR產物均通過Gold View染色處理,系統下觀察擴增條帶。選取部分PCR產物將其送檢獲得測序結果。對PCR反應產物準確性進行驗證,并分別運用不同的PCR產物實施測序,確定陽性對照組,并配合滅菌雙蒸水作為空白對照組,保障PCR質控。

1.3.6 限制性片段長度多態性分析各位點基因型:根據上述PCR產物來進行基因分型處理,在2.0%瓊脂糖凝膠電泳,對酶切產物進行切片處理,并配合Gold View染色,并觀察成像結果,結合酶切條帶對基因型進行判定。選取PTPN22基因-1123G/C位點基因型產物送檢測序,最后獲得同源性分析結果。

1.4 觀察指標 對兩組對象PTPN22-1123等位基因與基因型頻率進行統計對比,同時整理患者性別、年齡、免疫增強劑的歷史、病毒感染、遺傳史基本情況。

1.5 統計學方法 運用統計學軟件SPSS22.0行數據的分析處理,連續變量正態分布以表示,采用獨立樣本t檢驗,不符合正態分布的計量資料以中位數(四分位數)即M(P25,P75)表示,采用Mann-WhitneyU檢驗。行t檢驗;以行(%)表示計數資料,行χ2檢驗。本研究針對基因型頻率均通過直接計數法來實施計算,通過對各基因型分布情況進行檢驗,并通過年齡、性別等混雜基因實施調整,組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗,計算OR值和95%CI。以P<0.05為差異有統計學意義

2 結果

兩組對象兩種等位基因的頻數分布以及基因型頻數比較,GG、CC基因型頻率分布無差異(P>0.05),GC基因型頻率分布存在差異性(P<0.05)。對兩組三種基因型進行雙尾χ2檢驗,結果顯示有統計學差異(χ2=6.523,P=0.036),即表明 PTPN22-1123的SNPs與RA易感染之間存在密切相關性。通過對不同基因型進行進一步分析,結果顯示,雜合子GC型會導致患者RA發病風險增加1.966倍,而純合子CC型則不會導致RA發病風險增加。同時G、C等位基因在兩組中的雙尾 χ2檢驗結果也表現出差異性,其中攜帶C等位基因會導致RA的發病風險增加1.584倍。見表1。

表1 兩組對象中PTPN22-1123等位基因與基因型頻率比較[n(%)]

3 討論

目前,關于RA的發病機制尚不明確,但普遍認為RA的是一種復雜性疾病,表現出多基因多位點之間的共同作用。有研究者通過對孿生雙胞胎進行跟蹤調查發現,同卵雙生RA的疾病共發率達到了15%,而通過定量遺傳方法進行RA遺傳度評價,其結果達到了60%,即表明在RA發病中遺傳因素發揮了非常關鍵的作用[4]。

PTPN22是處于1號染色體短臂(lp13.3—13.1)的一種基因蛋白。近期有研究者發現,LYP與多種銜接分子相互結合,可導致T細胞的活化受到影響,故該基因被視為免疫性疾病的易感重要基因,包括RA、系統性紅斑狼瘡[5]。有研究者選取地中海RA群體對其基因型進行檢測,結果發現,其PTPN22 1858C>T SNP與RA發生發展表現出相關性[6-7]。但同時西班牙地區通過RA群體PTPN22基因型檢測,并未觀察到有任何異常情況[8-10]。這就表明PTPN22-1123表現出一定的地域差異特征。本研究選取浙江省金華地區RA群體,對其PTPN22-1123多態性進行檢測,結果發現,對照組GG、GC、CC三種基因型分布為55.00%、35.00%、10.00%,G、C等位基因分布為75.00%、30.00%。但在病例組中GG、GC、CC三種基因型分布為38.00%、50.00%、12.00%,G、C等位基因分布為64.00%、36.00%。該結果與日本GG、GC、CC三種基因型分布為15.00%、70.00%、15.00%,G、C等位基因分布為35.00%、65.00%,分布情況存在較大差異性(P<0.05),但與上海(GG、GC、CC三種基因型分布為36.00%、51.00%、13.00%,G、C等位基因分布為60.00%、40.00%)、廣東(GG、GC、CC三種基因型分布為40.00%、55.00%、5.00%,G、C等位基因分布為65.00%、35.00%)[11-12]等地區無明顯差異(P>0.05)。本研究對比發現,雜合子GC型基因頻率分布會導致RA發病風險增加,即表明通過對PTPN22-1123GC多態性進行測定,更利于RA易感性的測定。該結果與文獻結果一致[13],有研究者選取廣東RA人群進行PTPN22-1123多態性測定,結果顯示,其GC基因型、C等位基因表現出顯著差異,并認為GC型的測定更利于RA疾病的預防控制。但關于GC基因對RA易感性增強的具體機制尚不明確,推測可能是由于LYP經由C端富含脯氨酸基序以及CSK蛋白絡氨酸激酶的SH3結構域連接所致,其可使得TCR信號傳導發生改變,造成機體免疫平衡發生改變[14-16]。

綜上所述,針對浙江省金華地區人群,對其進行PTPN22-1123 GC多態性進行測定,可實現對RA易感性的早期判斷,為臨床診斷與預防提供客觀依據。