紅和綠香椿芽貯藏過程中花青素和木質素含量及相關基因表達分析

趙 倩,朱順華,蔡 霞,文曉鵬,譚國飛,孟平紅*

(1 貴州大學 生命科學學院/農業生物工程研究院,山地植物資源保護與保護種質創新教育部重點實驗室,貴陽 550025;2 貴州省農業科學院園藝研究所/貴州省園藝工程技術研究中心,貴陽 550006;3 吉林農業大學 農學院,長春 130118)

香椿(ToonasinensisL.),是中國特有的木本蔬菜之一[1-2],富含多種營養與活性物質,具有抗氧化、抗癌、抗炎、降血糖等保健功效[3-4]。根據香椿嫩芽的顏色,可將香椿分為紅香椿和綠香椿兩大類[5]。新鮮香椿芽含水量高,采后新陳代謝旺盛,在室溫下不耐貯藏,采后貯藏過程中紫紅色逐漸變為深綠色[6],且極易發生萎焉、腐爛、褐變及木質化等現象,貨架期短,嚴重影響了香椿的商品和經濟價值[7]。

低溫貯藏是果蔬貯藏常用的貯藏方式,在一定溫度范圍內,可抑制果蔬的呼吸作用和蒸騰作用,減少乙烯的釋放和營養物質的流失,延緩腐爛、衰老和組織褐變,延長貯藏期和貨架期[8]。近年來,關于香椿芽低溫貯藏的研究已有報道,主要集中在貯藏溫度[9]、包裝材料[10-13]、噴施外源物質[14-17]對紅香椿芽貯藏期間營養物質、微生物多樣性及酶活性變化的影響等方面。

花青素和木質素作為香椿芽的重要物質成分,是評價香椿芽品質優劣的重要指標之一。研究香椿芽采后貯藏過程中花青素和木質素含量對其品質調控具有積極意義。然而,國內外對香椿芽采后花青素和木質素含量變化的研究較少。本研究以4月上旬采自貴州省織金縣板橋鎮紅光村相同樹齡(4年)的紅和綠香椿芽為試驗材料,觀察香椿芽采后低溫貯藏過程中色澤變化,并測定香椿芽葉和葉柄花青素和木質素含量,且通過石蠟切片觀察其葉和葉柄木質部細胞的變化。另外,根據課題組建立的香椿芽轉錄組數據庫,檢索和鑒定與香椿芽花青素和木質素合成途徑相關基因,并利用qRT-PCR對紅和綠香椿芽葉和葉柄花青素與木質素合成相關基因的表達水平進行分析,旨在為進一步指導香椿芽貯藏保鮮及其品質調控研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料采集和固定

2022年4月上旬,采摘種植于貴州省織金縣板橋鎮紅光村(105.71°E, 26.79°N)相同樹齡(4年)、生長狀況一致、無機械損傷的紅和綠香椿芽。采摘后分別裝入聚乙烯包裝袋中進行4 ℃低溫黑暗貯藏。分別于貯藏0 d(采摘當天)、1 d、2 d、3 d的同一時間(早上7:00)取樣。取樣時選取不同貯藏期的紅和綠香椿芽各3個,進行3次生物學重復,分別將紅和綠香椿芽的葉片和葉柄用錫箔紙包好,一部分快速放入液氮中速凍,并保存于-80 ℃冰箱,用于紅和綠香椿芽葉片和葉柄RNA的提取和花青素含量的測定,一部分置于烘箱80 ℃烘干至恒重,用于木質素含量的測定。同時,分別取紅和綠香椿芽不同貯藏期葉片及葉柄用FAA(Formalin-Aceto-Alcohol)固定液(70%酒精90 mL,福爾馬林5 mL,冰醋酸5 mL)[18]進行固定,用于組織切片,觀察葉脈和葉柄的組織結構。

1.2 香椿芽色澤及葉片、葉柄組織結構觀察

先仔細觀察不同貯藏時期香椿芽的色澤變化,然后制作石蠟切片和進行組織化學染色。用FAA固定液分別將不同貯藏期紅、綠香椿芽同一部位的葉片和葉柄固定24 h,經乙醇梯度脫水,使用石蠟浸透與包埋。

利用石蠟切片機將樣品切成4 μm厚的切片,用番紅—固綠染色液染色,乙醇梯度脫色脫水后封片,最后在光學顯微鏡下(NIKON ECLIPSE E100,尼康儀器上海有限公司)觀察葉脈及葉柄組織結構,并進行拍照。

1.3 香椿芽葉片和葉柄花青素和木質素含量測定

1.3.1 花青素含量

花青素的提取及其含量的測定參照王歡等[19]和譚國飛等[20]的方法進行。

具體步驟:使用液氮將采后不同貯藏期紅和綠香椿芽葉片和葉柄研磨成粉末后,各稱取約0.2 g放入20 mL 95%乙醇中,室溫暗光下浸提8 h。浸提液用0.25 μm濾頭過濾后,使用紫外分光光度計(Alpha-1860,上海譜元儀器有限公司)測定其在530,620,650 nm波長下的吸光度值D530、D620和D650。

根據公式[D=(D530-D620)-0.1(D650-D620)]并按照0.1個吸光度為1個花青素單位,計算不同貯藏期紅和綠香椿芽葉片和葉柄花青素含量。每個樣品進行3次生物學重復。

1.3.2 木質素含量

取不同貯藏期的紅、綠香椿芽葉片和葉柄干樣置于研缽研磨成粉末,過30～50目篩,然后使用Solarbio生物科技有限公司的木質素含量檢測試劑盒,提取木質素并計算木質素含量。每個樣品進行3次生物學重復

1.4 香椿芽葉片和葉柄花青素和木質素合成相關基因的表達分析

1.4.1 RNA提取及cDNA合成

將-80 ℃冰箱保存的香椿芽樣品,分別置于滅菌的研缽中,用液氮將不同貯藏期紅和綠香椿芽葉片和葉柄研磨成粉末。各取約0.1 g裝入2 mL無酶的離心管中,采用植物 RNA 提取試劑盒(北京華越洋生物科技有限公司,GX型)提取香椿芽的總 RNA。

使用1.5%的瓊脂糖凝膠檢測香椿芽總RNA的完整性及使用微量分光光度計Nanodrop ND-100 (Nanodrop Technology Inc., DE, USA)檢測香椿芽總RNA的濃度。利用HiScriptⅢ 1st Strandc DNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司,該試劑盒中有去除基因組成分),按照說明書將提取的RNA反轉錄為 cDNA。最后,用滅菌的ddH2O 稀釋15倍,保存于-20 ℃冰箱備用。

1.4.2 花青素和木質素合成相關基因的表達分析

根據花青素和木質素合成的代謝通路,從香椿芽轉錄組數據庫中檢索獲得花青素合成基因苯丙氨酸解氨酶基因(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、肉桂酸-4-羥化酶基因(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)、查爾酮合成酶基因(chalcone synthase,CHS)、查爾酮異構酶基因(chalcone isomerase,CHI)、黃烷酮-3-羥化酶基因(flavanone 3-hydroxylase,F3H)、類黃酮3′,5′羥化酶基因(flavonol 3′,5′ hydroxylase,F3′5′H)、二氫黃酮醇還原酶基因(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)、花青素合成酶基因(anthocyanidin synthesis,ANS)、花青素-3-O-葡萄糖基轉移酶基因(anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase,3GT)等9個,以及木質素合成基因4-香豆酸輔酶A連接酶基因(4-coumarate CoA ligase,4CL)、肉桂酰輔酶A還原酶基因(cinnamoyl-CoA reductase,CCR)、肉桂醇脫氫酶基因(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)、莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉移酶基因(shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase,HCT)、香豆酸-3-羥化酶基因(coumaroyl shikimate/quinate 3′-hydroxylase,C3′H)、咖啡酸-O-甲基轉移酶基因(caffeic acidO-methy Itransferase,COMT)、阿魏酸-5-羥化酶基因(ferulate 5-hydroxylase,F5H)、咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶基因(caffeoyl CoAO-methy Itransferase,CCoAOMT)和漆酶基因(Laccase,LAC)等9個。

以香椿Actin基因(TsActin)作為內參基因,設計qRT-PCR引物(引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,表1)。使用SYBR PremixExTaq 試劑盒(TaKaRa,大連)進行熒光定量實驗。反應體系為20 μL,包括10 μL 2×SYBR qPCR Master Mix,2 μL稀釋的模板cDNA,上、下游引物各0.5 μL,7 μL滅菌的ddH2O,香椿TsActin基因與目的基因一起擴增。每個樣品進行3次生物學重復。PCR反應程序為:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性10 s,54 ℃退火30 s,65 ℃延伸10 s,40個循環;最后8 ℃保存。相對定量表達參照2-ΔΔCT法。

表1 花青素和木質素合成相關基因的qRT-PCR引物

1.5 數據分析

用Microsoft Excel 2007軟件作數據統計分析,用IBM Statistics 20.0軟件進行顯著性分析,顯著水平設置為0.05。

2 結果與分析

2.1 香椿芽貯藏過程中色澤和葉脈、葉柄解剖結構的變化

香椿芽采后4 ℃低溫黑暗貯藏過程中,紅香椿芽貯藏3 d后仍色彩鮮艷,而綠香椿芽采后貯藏1 d葉柄開始出現黑色斑點,隨貯藏時間的延長,黑色斑點逐漸增加,且黑色逐漸加深(圖1),表明綠香椿芽的貯藏時間短。同時,紅、綠香椿芽在采后貯藏期間,葉片紫紅色逐漸變淺,而葉柄的顏色變化甚微。

A. 紅香椿芽;B. 綠香椿芽;Ⅰ. 0 d; Ⅱ. 1 d; Ⅲ. 2 d; Ⅳ. 3 d。下同。

番紅染液可以使細胞壁中的木質素呈現紅色,染色時染色程度越深說明木質素含量越高[21]。利用顯微鏡觀察紅、綠香椿芽采后4 ℃低溫貯藏過程中葉脈和葉柄細胞結構的變化。結果表明,紅香椿芽葉脈(圖2,A-Ⅰ～A-Ⅳ)和葉柄(圖3,A-Ⅰ～A-Ⅳ)木質部細胞比綠香椿芽葉脈(圖2,B-Ⅰ～B-Ⅳ)和葉柄(圖3,B-Ⅰ～B-Ⅳ)木質部細胞小且細胞數量少;紅、綠香椿芽采后貯藏過程中,次生細胞壁逐漸增厚,且細胞染色程度上綠香椿芽葉及葉柄紅色較深,表明紅、綠香椿芽貯藏過程中均發生了木質化,但綠香椿芽的木質化程度更高。另外,蒸騰作用使組織細胞失水而失去新鮮狀態[22],貯藏過程中紅香椿芽葉脈和葉柄的木質部細胞逐漸增大;而綠香椿芽葉脈和葉柄木質部細胞先增大(0～1 d)后變小(2～3 d),表明貯藏過程中綠香椿芽的蒸騰作用較強,水分流失嚴重。

A. 紅香椿芽;B. 綠香椿芽;Ⅰ. 0 d; Ⅱ. 1 d; Ⅲ. 2 d; Ⅳ. 3 d; X. 木質部。下同。

圖3 4 ℃低溫貯藏期間香椿芽葉柄結構

2.2 香椿芽貯藏過程中葉片和葉柄花青素和木質素含量的變化

圖4,A顯示,在4 ℃低溫貯藏期間,紅香椿芽葉片和葉柄中花青素含量始終明顯高于相應的綠香椿芽,而在同一品種香椿芽內又表現為葉片中花青素含量始終高于葉柄。其中,隨貯藏時間的延長,紅、綠香椿芽葉片和葉柄花青素含量均逐漸降低,貯藏3 d時紅香椿芽葉片和葉柄花青素含量分別比采摘當天降低35.88%、33.33%,綠香椿芽葉片和葉柄花青素含量則比采摘當天分別顯著降低了39.13%、37.50%,表明綠香椿芽中花青素降解速率較快。香椿芽木質素含量的高低是評價香椿芽品質的重要因素。從圖4,B可知,在低溫貯藏期間,2個香椿品種芽內木質素含量差異較大,始終表現為綠香椿芽木質素含量高于紅香椿芽,且紅、綠香椿芽中葉柄木質素含量高于葉片。

不同小寫字母表示各貯藏時期間差異顯著(P<0.05)。下同。

其中,隨貯藏時間延長,紅香椿芽葉片木質素含量逐漸升高,其葉柄木質素含量先上升后下降,而同期的綠香椿芽葉片和葉柄木質素含量均呈先上升后下降的趨勢;與貯藏0 d時相比,兩個品種香椿芽葉片和葉柄中木質素含量總體均呈升高趨勢,在貯藏3 d時紅香椿芽葉片和葉柄中木質素含量分別顯著升高了77.94%和48.71%,綠香椿芽則分別升高了15.30%和30.46%,表明香椿芽在冷藏過程中,紅香椿芽中木質素的積累速率較快。

2.3 香椿芽葉片和葉柄花青素和木質素合成相關基因表達量的變化

在紅香椿芽中,隨著貯藏時間的延長,花青素合成相關基因TsPAL(葉柄)和TsC4H的表達量均呈先升高后下降趨勢,TsCHS、TsF3H和TsANS的表達量均呈逐漸降低的趨勢,TsPAL(葉片)和Ts3GT的表達量呈先降低后升高,然后再降低的趨勢;而TsCHI、TsF3′5′H和TsDFR的表達量在紅香椿芽葉片和葉柄中的變化趨勢不一致,如TsCHI在葉片的表達量呈逐漸降低的趨勢,在葉柄中則呈現先升高后降低的趨勢。

在綠香椿芽中,隨著貯藏時間的延長,葉片和葉柄中TsPAL基因的表達量均呈先升高后降低的變化趨勢,TsCHI和TsF3H基因的表達量均呈逐漸降低的趨勢;而TsC4H、TsCHS、TsF3′5′H、TsDFR、TsANS和Ts3GT基因的表達量在綠香椿芽不同組織中存在差異,但整體均呈現下降趨勢(圖5)。

圖5 低溫貯藏期間香椿芽花青素合成基因的相對表達量

可見,在香椿芽低溫貯藏過程中,葉片和葉柄中各花青素合成相關基因的表達量均發生了顯著變化,但變化趨勢存在差異,除TsPAL和TsC4H基因外,其他花青素合成相關基因的表達量均顯著下降。

同時,不同品種香椿芽葉片和葉柄冷藏過程中木質素合成相關基因的表達水平具有顯著差異。紅香椿芽采后冷藏過程中,TsHCT基因在葉片中的表達量顯著升高,而在葉柄中的表達量則降低;TsCAD、TsC3′H、TsCOMT、TsF5H和TsCCoAOMT基因的表達量在紅香椿芽葉柄中呈現升高的趨勢,而在紅香椿芽葉片中的表達量降低。在綠香椿芽葉片冷藏過程中,Ts4CL、TsHCT和TsCCoAOMT基因的表達量升高,其中Ts4CL和TsHCT基因的表達量顯著升高;而TsCAD、TsC3′H、TsCOMT和TsLAC基因的表達量顯著下降;TsCCR和TsF5H基因的表達量下降,但差異不顯著。在綠香椿芽葉柄冷藏過程中,TsCCR、TsHCT、TsF5H、TsCCoAOMT和TsLAC基因的表達量升高,其中TsCCR、TsHCT和TsLAC基因的表達量顯著升高,而Ts4CL、TsCAD、TsC3′H和TsCOMT基因的表達量下降,但差異不顯著(圖6)。

圖6 低溫貯藏期間香椿芽木質素合成基因的相對表達量

3 討 論

花青素是存在于果蔬中的一種天然水溶性色素,可以作為評價果蔬新鮮程度和綠色植物衰老的指標[23-24]。本研究中紅和綠香椿芽花青素含量在采后4 ℃低溫黑暗貯藏過程中隨貯藏時間的延長呈逐漸下降的趨勢,這與范林林等[25]關于茄子果皮中花青素含量在貯藏過程中變化趨勢的報道一致,即果蔬貯藏過程中衰老現象的產生與花青素的降解密切相關。從貯藏性能來看,本研究中綠香椿芽采后低溫貯藏1 d開始出現黑色斑點,且黑色斑點隨貯藏時間的增加而逐漸增多,而紅香椿芽在采后貯藏3 d也未有黑色斑點產生,表明綠香椿芽的貯藏時間短,貯藏保鮮困難。另外,香椿芽不同部位的衰老速度也存在差異,葉柄花青素降解速度比葉片快。

木質素是植物細胞壁的主要成分,也是影響果蔬采后貯藏品質的重要因素[26]。研究表明,‘濰縣蘿卜’肉質根貯藏過程中木質素含量顯著增加,這與蘿卜肉質根的糠心程度顯著增加高度相關[27]。竹筍在采后4 ℃低溫貯藏過程中,木質素含量呈逐漸上升的趨勢,硬度增加,品質下降[28-29]。本研究發現,香椿芽在采后4 ℃低溫貯藏過程中表現出葉脈和葉柄的次生細胞壁逐漸增厚,木質素含量逐漸增加。另外,本實驗中綠香椿芽的木質素含量比紅香椿芽高,且紅和綠香椿芽葉柄的木質素比葉片高,表明綠香椿芽不耐貯藏以及葉柄的貯藏性能差。同時,香椿芽在低溫冷藏過程中紅香椿芽中木質素的積累速度較快,可能是由于將紅香椿芽采收后放于4 ℃進行冷藏,溫度差異變化較大所致。此外,木質素的積累還會引起果銹及褐變現象的產生[30-31]。香椿芽貯藏過程中,綠香椿芽產生黑色斑點的時間比紅香椿芽早,表明香椿芽采后黑色斑點的產生與貯藏過程中木質素的積累密切相關。

花青素和木質素均是植物苯丙烷類代謝的產物,研究表明,花青素和木質素相關基因的上調和下調表達可以顯著增加或減少花青素和木質素的含量[32-35]。香椿芽采后貯藏過程中,花青素和木質素合成相關基因(除TsPAL和TsC4H)的表達水平與花青素和木質素的含量變化趨勢一致,表明香椿芽采后貯藏過程中花青素和木質素含量的差異與合成相關基因的表達水平具有一定的相關性。在香椿芽貯藏過程中,TsPAL和TsC4H的表達水平呈現先升高后下降的趨勢,且整體呈下降趨勢,這可能是由于TsPAL和TsC4H既可以調控花青素的合成,也可以調控木質素的合成,且在貯藏前期主要調控木質素的合成,而在貯藏后期參與調控花青素的合成。TsPAL和TsC4H基因是否在貯藏前期參與香椿芽木質素合成,在貯藏后期參與花青素的合成還需要進一步探究。

綜上所述,在紅、綠香椿芽采后4 ℃低溫貯藏過程中,葉片、葉柄組織的花青素含量降低,木質素含量升高,而次生細胞壁增厚,發生了不同程度的木質化。同時,紅香椿芽的花青素含量比綠香椿芽高,而木質素含量比綠香椿芽低。綜合香椿芽色澤、外觀、花青素和木質素含量變化特征,表明紅香椿芽的貯藏時間較長,且葉柄貯藏保鮮比葉片更困難。另外,葉片、葉柄組織中花青素和木質素合成相關基因的表達量與香椿芽貯藏過程中花青素和木質素含量的變化趨勢一致。本研究結果對于指導紅和綠香椿芽的貯藏保鮮和食用具有實際意義,也為通過調控花青素和木質素基因表達水平來提高香椿芽采后品質提供了理論依據。