歐李種質資源果實酚類物質分析及種質評價

邵郅勝,張 薇,孫 聰,郭金麗

(內蒙古農業大學 園藝與植物保護學院,呼和浩特 010018)

歐李(Cerasushumilis)屬薔薇科櫻桃屬極矮生灌木,為我國特有野生果樹資源[1],主要分布于內蒙古、山西、遼寧、河北等北方地區。歐李果實香氣濃郁、風味獨特,同時富含酚類物質、氨基酸、維生素和Ca、Fe、Se等,備受人們關注[2]。歐李資源豐富,具有抗旱、抗寒、耐瘠薄,綜合適應性強的特點,適用于寒旱地區經濟林建設及生態修復治理[3-4]。歐李果實鮮食加工俱佳,可深加工成果酒、果汁、果醬、紅色素等系列產品[5]。此外,歐李仁可入藥[6],葉可制茶[7]。歐李集果、種子、葉等綜合開發利用于一身,具有極高的營養價值、藥用價值和生態價值,開發前景廣闊[8]。酚類物質是一類重要的果蔬次生代謝物質,廣泛存在于植物組織中,可有效抑制細菌、真菌等病原體的侵染,在抵抗病原菌方面發揮重要作用[9-10]。酚類物質對果實色澤、口感風味、產品褐變等方面[11-12]具有重要影響;在人類健康方面具有抗氧化、清除自由基、預防心血管疾病、延緩機體衰老等多種生理活性和功能[13-18]。

本課題組[19]初步研究表明,歐李果實中酚類物質含量豐富,酚類物質及其抗氧化特性是歐李果實品質的重要特征之一,研究了解歐李果實酚類物質及抗氧化的特性特征,可為歐李果實品質提升、品種選育等進一步研究應用打下基礎。內蒙古高原作為中國歐李集中分布區域之一,具有豐富多樣的歐李種質資源。本課題組多年來進行內蒙古地區歐李種質資源收集與研究,從豐富多樣的內蒙古歐李種質資源中初步篩選出部分優系資源開展進一步深入研究。在前期工作的基礎上,本試驗以內蒙古36種歐李優系資源為材料,對果實酚類物質、抗氧化活性、酸度、果肉色4個品質性狀的9個指標,利用主成分分析、相關性分析、綜合聚類分析等相結合的方法,進行種質評價,探討歐李果實品質性狀之間的聯系,同時為內蒙古歐李優異資源篩選及進一步研究和應用提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

36種歐李優系資源來源于內蒙古農業大學歐李科研基地(40°56′19.48″N,111°57′34.95″E)資源圃,通過實生選種方式于2019年于資源圃內選出優良單株,之后通過綠枝扦插無性擴繁形成36份內蒙古歐李優系資源(以MY1-52表示)。每份資源各選取30株進行標記, 10株為 1 次重復,重復 3 次。2021年7月下旬至9月下旬于36種歐李優系資源果實完熟期分別于結果枝的上、中、下部選擇果個均勻一致、無病蟲害、無機械傷的果實組成樣本,洗凈晾干后液氮速凍,于-80 ℃冰箱中保存待測。

1.2 提取液制備

取適量歐李果實去核后切碎,稱取3.0 g放入研缽,以0.1%鹽酸的40%乙醇水溶液做提取液,加50 mL提取液磨碎,超聲波清洗儀25 ℃提取1 h,反復提取 3 次,過濾定容至50 mL量瓶,提取液5 000 r/min離心10 min,上清液即為果實提取液,-20 ℃儲存待測。3次重復。

1.3 測定方法

1.3.1 果肉色

取歐李果實縱切,目測將果肉顏色歸為三大類,淺紅、桔黃、紅,并賦值(淺紅=1,桔黃=2,紅=3)。

1.3.2 酚類物質

總酚、總黃酮、原花青素含量參照邵郅勝[20]試驗方法進行測定。

1.3.3 抗氧化活性

抗氧化活性4個指標均參照邵郅勝[20]的試驗方法,略有改動。

總抗氧化:取1 mL提取液、6 mL 鐵離子還原能力(FRAP)工作液、0.6 mL蒸餾水,混合搖勻后于37 ℃水浴20 min。在593 nm 處,用無水乙醇調零,測吸光度。標準曲線以FeSO4溶液制作,用無水乙醇配制FeSO4溶液(濃度梯度200～6 000 μg/ mL),測定標準系列溶液的吸光值,做標準曲線,以無水乙醇代替樣品做空白,根據吸光值,求得相應 Fe2+當量定義FRAP值[CVN/1000M,C為樣品減去空白吸光度代入Fe2+當量(μmol/L),V為待測液總體積(L),N為樣品稀釋倍數,M為樣品質量(g)]。

總還原力:依次加入2.5 ml pH 7.0磷酸鹽緩沖液、100 μL果實提取液、2.5 mL 30.37 mmol/L鐵氰化鉀,混勻,50 ℃恒溫水浴20 min,加入2.5 mL 0.6 mol/L三氯醋酸溶液終止反應。反應體系中取2.5 mL上清液,加2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 3.70 mmol/L FeCl3溶液,反應10 min后于700 nm處測定吸光值;以蒸餾水代替提取液作空白。

·OH清除率:依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4、1 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液、400 μL果實提取液,混勻,加入2 mL 8 mmol/L H2O2,4.6 mL蒸餾水,混勻, 37 ℃水浴60 min后取出冷卻,于510 nm處測定吸光值;以蒸餾水代替提取液做空白,蒸餾水代替H2O2作為對照。按·OH清除率=[A空白-(A樣品-A對照)]/A空白×100%計算。

DPPH·清除率:依次加入2 mL果實提取液、2 mL 0.1 mg/mL DPPH甲醇溶液,混勻,避光反應60 min,于517 nm處測吸光值;以甲醇代替提取液作對照。按DPPH·清除率=(A對照-A樣品)/A對照)×100%計算。

1.3.4 可滴定酸

可滴定酸含量采用滴定法測定。

1.4 數據分析

采用Excel 2010統計軟件進行數據分析處理,利用SPSS 26.0軟件進行相關性分析、主成分分析及系統聚類。

2 結果與分析

2.1 歐李優系資源果實品質性狀的變異分析

歐李果實酚類物質、抗氧化活性、酸度及果肉色的差異和多樣性分析見表1。果實總酚含量變幅為555.33～1 090.89 mg/(100 g),最大值為最小值的1.96倍,均值為774.35 mg/(100 g),變異系數為16.80%;總黃酮含量變幅為191.56～679.33 mg/(100 g),最大值為最小值的3.55倍,變異系數為31.03%;原花青素含量變幅為222.73～483.94 mg/(100 g),最大值為最小值的2.17倍,變異系數為19.25%。果實總抗氧化活性變幅為9.96～22.09 μmol/g,最大值為最小值的2.22倍,均值為14.70 μmol/g,變異系數為22.12%;總還原力在18.27%～37.70%范圍內變化,最大值為最小值的2.06倍,變異系數為17.33%;·OH清除率變幅為38.52%～50.43%,均值為45.31%,變異系數為6.66%;DPPH·清除率在28.49%～63.53%范圍內變化,最大值為最小值的2.23倍,變異系數為18.96%。果實可滴定酸含量變幅為1.31%～1.79%,變異系數小,僅為5.91%;而果肉色變異系數則高達30.29%。不同歐李資源類型之間果實的酚類物質含量、抗氧化活性、酸度及果肉色均有不同程度的差異。3種酚類物質中,總黃酮含量的變異程度最高,原花青素含量次之,總酚含量最低;4種抗氧化活性中,變異程度由高到低的順序依次為總抗氧化活性、DPPH·清除率、總還原力及·OH清除率。可滴定酸含量變異系數最小(5.91%)。果肉色劃分為紅、桔黃、淺紅三大類,變異系數高達30.29%。由上可見,36份歐李優系資源多個品質性狀指標均具有豐富的遺傳多樣性,不同優系資源間性狀差異較大,適合進行優異種質分析與評價。

表1 歐李優系資源果實品質性狀分析

2.2 歐李優系資源品質性狀間的相關性分析

36份歐李優系資源果實酚類物質含量、抗氧化活性、酸度及果肉色4個品質性狀的9項指標相關性分析表明:果實總酚、總黃酮、原花青素三者間均表現為極顯著正相關,其中總酚與總黃酮相關程度(0.865)最高。果實4項抗氧化指標中,總還原力、·OH清除率和DPPH·清除率三者間均表現為極顯著正相關,其中還原力與·OH清除率相關程度(0.539)最高;而總抗氧化活性與其他三項抗氧化指標的相關性均不顯著。果實總酚和總黃酮含量均與總還原力、·OH清除率和DPPH·清除率存在顯著正相關,相關程度表現為DPPH·清除率>總還原力>·OH清除率;原花青素含量與總還原力、·OH清除率和DPPH·清除率均表現為極顯著正相關,與總抗氧化表現顯著正相關,相關程度表現為總還原力>·OH清除率>DPPH·清除率>總抗氧化。果實可滴定酸含量僅與總黃酮含量呈顯著負相關,與其他指標相關性不顯著。果肉顏色與總酚含量表現極顯著正相關,與總黃酮、原花青素及DPPH·清除率均呈顯著正相關。從酚類物質與抗氧化活性的相關程度來看,3種酚類物質與總抗氧化活性、總還原力、·OH清除率三者的相關系數均表現為原花青素>總酚>總黃酮;與DPPH·清除率的相關系數表現為總酚>總黃酮>原花青素。綜上可見,歐李果實各酚類物質含量之間關聯緊密,同時抗氧化活性指標、可滴定酸含量及果肉色三者基本均與歐李果實各酚類物質含量存在不同程度的相關性(表2)。

表2 歐李果實不同品質性狀相關性分析

2.3 歐李優系資源品質性狀間的主成分分析

基于36份歐李優系資源9項指標的主成分分析(表3),由表3可知,共劃分3個主成分(F1～F3),貢獻率分別為46.21%、15.13%和12.20%,累計貢獻率達73.54%;同時3個主成分的特征值均大于1,其中F1的提取特征值為4.159。提取的3個主成分可反映優系材料品質性狀73.54%的信息,可作為評價歐李優系資源品質性狀的重要指標。由表4可知,F1主要由載荷因子分別為0.870、0.811、0.843、0.776、0.643、0.781和0.539的總酚、總黃酮、原花青素、總還原力、·OH清除率、DPPH·清除率和果肉色決定,稱為酚類因子;F2主要由載荷因子為0.873的可滴定酸含量決定,稱為酸度因子;F3主要由載荷因子為0.898的總抗氧化活性決定,稱為總抗氧化因子。綜上所述,總酚、總黃酮、原花青素、總抗氧化、總還原力、·OH清除率、DPPH·清除率、酸度和果肉色可作為評價歐李優系資源品質性狀的重要指標。

表3 主成分特征值、貢獻率及累計貢獻率

表4 因子載荷矩陣

2.4 品質性狀的主成分得分和綜合評價

根據主成分分析中提取的3個主成分進行得分綜合評價,先建立歐李種質綜合評價數學模型:F=[10×(46.213×F1+15.132×F2+12.197×F3)/73.542]+60,通過公式計算歐李種質品質性狀的綜合得分,由高到低進行優良排序,綜合得分越高,歐李優系種質綜合性狀越好,結果見表5。排名在前10的歐李優系由高到底分別為MY37、MY36、MY50、MY47、MY5、MY38、MY17、MY41、MY16和MY1,綜合得分范圍是66.45～84.53。上述10個優系中有6個總酚含量均在900 mg/(100 g)以上;8個優系總黃酮含量在500 mg/(100 g)以上;6個優系原花青素含量在400 mg/(100 g)以上;抗氧化力突出,同時果肉色基本均為紅色。排名前10的歐李優系綜合表現優異(表6)。排名在后10的優系資源綜合得分范圍是29.61～52.46,由低到高分別為MY9、MY10、MY19、MY20、MY6、MY51、MY30、MY12、MY18、MY2。此部分資源酚類物質含量較低,抗氧化能力較差,果肉色大多為淺紅和桔黃,綜合表現差。

表6 排名前10的歐李優系資源各指標信息

2.5 歐李優系資源的聚類分析及評價

采用歐氏距離法對標準化后的9個指標進行系統聚類分析,最終將36份歐李優系資源劃分為4大類(圖1)。

圖1 36種歐李優系資源系統聚類譜系圖

由表7和表8可知,第Ⅰ類群中的優系共7個,分別為MY5、MY36、MY37、MY38、MY41、MY47、MY 50,占比19.44%,均在綜合得分排名的前10位之列;第Ⅱ類群中的優系最少,僅1個,為MY40。

表7 3類歐李優系資源各指標均值差異性分析

表8 36種歐李優系資源聚類結果

第Ⅰ、Ⅱ類群均具有各酚類物質含量高及綜合抗氧化能力強的特點,果肉色多為紅色,主要區別在于第Ⅱ類群的MY40,可滴定酸含量更低,為1.31%。第Ⅲ類群中的優系資源共25個,占比最高,為69.44%,此類群具有各酚類物質含量及綜合抗氧化能力適中,可滴定酸含量偏高的特點。第Ⅳ類群中的優系資源共3個,分別為MY6、MY9、MY10,占比8.33%,此類群具有各酚類物質含量偏低、綜合抗氧化能力較弱及可滴定酸含量高的特點,果肉色為淺紅和桔黃。

3 討 論

實生選種是對種子實生繁殖后產生的變異進行選擇,從而篩選出性狀優異的優良種質資源,是植物優良種質資源篩選及新品種培育的主要方式[21]。歐李具有早果特性,實生選種亦作為歐李優良種質資源篩選及進一步新品種選育的常用途徑[22]。遺傳多樣性是歐李新品種選育的基礎,本研究對實生選種選出的36份歐李優系資源果實酚類物質、抗氧化性、酸度及果肉色4類品質性狀的9個指標變異系數及相關性進行分析,結果表明,9個指標變異系數范圍為5.91%～31.03%,36份優系資源品質性狀間存在豐富的遺傳多樣性,其中總黃酮和總抗氧化的變異系數較高。3種酚類物質均與總還原力、DPPH·清除率、·OH清除率和果肉色存在正相關關系,與酸度的相關系數均為負值,三類品質性狀與酚類物質均存在著緊密的聯系。牛帥科等[23]在葡萄上,嚴娟等[24]在桃果肉上也發現果肉色與酚類物質有類似的關系。綜上,研究的9項指標可以作為歐李優良種質篩選及品種選育的重要參考指標。

通過主成分分析法將9項品質性狀指標轉化為彼此獨立的3個指標,分別為酚類因子、酸度因子和總抗氧化因子。結合相關性分析結果,總抗氧化活性與酚類物質相關性較其他3個抗氧化指標較差,同時又被劃分為獨自的主成分,可知總抗氧化受果實中其他物質影響較大,如維生素C等。基于提取的3個主成分及建立的歐李種質綜合評價數學模型:F=[10×(46.213×F1+15.132×F2+12.197×F3)/73.542]+60, 對36份歐李優系進行綜合得分評價。排名前10的優系資源酚類物質含量高,抗氧化能力強,果肉多為紅色;后10位的優系資源酚類物質含量低,抗氧化能力較弱,果肉多為桔黃和淺紅色,不宜作為高酚類歐李種質資源。

本試驗以9項品質指標為參數通過系統聚類將36份優系資源聚為4大類:第Ⅰ類群包括MY5、MY36、MY37、MY38、MY41、MY47、MY50,為酚類物質積累型,多為紅果肉,此類群可作為高酚類歐李種質資源及進行后續研究及應用;第Ⅱ類群為MY40,與前一類群主要區別在于酸度,MY40可滴定酸含量更低,為1.31%,可作為特異的低酸高酚種質資源進行后續研究;第Ⅲ類群中的優系資源共25個,此類群具有各酚類物質含量及綜合抗氧化能力適中,可滴定酸含量偏高的特點;第Ⅳ類群包括MY6、MY9、MY10,此類群酚類物質含量低,抗氧化能力弱,可滴定酸含量高,果肉色多為淺紅和桔黃,此類群不宜作為高酚類歐李種質資源,但可作為高酸低酚種質資源用于其他研究。

4 結 論

本研究差異性及相關性分析表明,36份歐李優系資源的4類品質性狀聯系緊密,遺傳多樣性豐富。主成分分析將9個品質性狀指標歸為累計貢獻率達73.54%的3個主成分,分別為酚類因子、酸度因子和總抗氧化因子。通過建立的種質綜合評價數學模型,篩選出酚類品質優異的優系資源10份,分別為MY37、MY36、MY50、MY47、MY5、MY38、MY17、MY41、MY16和MY1。通過系統聚類分析,最終聚為4大類,第Ⅰ類群包括7份優系資源,分別為MY5、MY36、MY37、MY38、MY41、MY47、MY50,為酚類物質積累型,多為紅果肉,同時這7份優系資源綜合得分均在前10位,此類群可作為高酚類品質歐李種質資源。