鹽脅迫下寧夏枸杞苯丙烷代謝相關基因差異表達分析

宋 繁,胡進紅,梁旺利,梁文裕,王玲霞

(寧夏大學 生命科學學院, 銀川 750021)

寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)是主要分布于寧夏、內蒙古、新疆等干旱或半干旱地區的多年生灌木,其果實具有很高的藥用和營養價值,是當地重要的栽培藥用植物資源。同時,寧夏枸杞適宜在鹽堿、干旱和沙荒地種植,具有較強的耐鹽性。長期的鹽生環境使寧夏枸杞進化出了一系列適應鹽脅迫的機制,包括離子選擇性吸收[1]、滲透調節物質積累[2]、活性氧自由基(ROS)清除[3]和葉片超微結構改變等[4]。目前越來越多的研究表明寧夏枸杞可通過形態結構、生理生化及分子水平等方面的變化協同適應鹽脅迫。

植物苯丙烷代謝途徑是合成酚類、類黃酮和木質素等次生代謝物的主要途徑。這些次生代謝物構成植物體內重要的非酶抗氧化防御系統,可以清除過多的ROS,減緩植物在逆境脅迫下的膜脂過氧化和其他氧化損傷。研究發現通過改變苯丙烷代謝途徑中相關基因的表達水平,進而調控酶活性及代謝物質積累是植物應對非生物脅迫的一種重要防御機制[5]。

鹽脅迫下草莓[6]、紅果龍葵[7]、刺柏[8]、鼠尾草[9]和秋茄[10]通過上調苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、類黃酮-3-羥化酶(F3H)、二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)、黃酮醇合酶(FLS)和查耳酮合成酶(CHS)等苯丙烷代謝途徑相關基因的表達,促進酚類、類黃酮物質的積累,使得這些植物的耐鹽性提高。

此外,鹽脅迫可通過誘導類黃酮合成相關基因F3H和查耳酮異構酶基因(CHI)的表達來提高胡蘿卜對鹽的耐受性[11]。擬南芥鹽馴化過程中與木質素合成相關的7個基因表達上調,促進木質素的合成,使擬南芥細胞壁木質化、減少水分蒸騰,維持正常的膨壓[12]。

由此可見植物酚類、類黃酮和木質素等的合成與植物耐鹽性具有明顯的相關性,研究其合成相關基因的差異表達有利于闡明植物耐鹽機制。但是目前對于寧夏枸杞酚類、類黃酮、木質素這類化合物合成相關基因如何表達以適應鹽脅迫還鮮見報道。因此,本研究利用高通量測序技術和實時熒光定量技術對鹽脅迫下寧夏枸杞苯丙烷代謝途徑中相關基因的表達規律進行分析,并對該途徑中關鍵酶的活性及產物含量進行測定,為進一步研究寧夏枸杞耐鹽機制提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗所用品種‘寧杞1號’種子由寧夏農林科學院枸杞工程技術研究所惠贈。枸杞種子經萌發1 d后種植于花盆(6.5 cm×7.5 cm)中,以珍珠巖、蛭石與基質按 1∶1∶1 比例混合作為培養基質,用Hoagland營養液進行澆灌。在溫度(25 ± 2) ℃、濕度42%、光強60 μmol/(m2·s)、光照時間12 h 的條件下進行培養。1個月后,選擇長勢一致且健康的幼苗移栽水培,繼續培養2個月后,進行100,200,300 mmol/L NaCl鹽脅迫處理,以不加NaCl的Hoagland營養液為對照。每個處理設3個重復。在鹽處理后第7天采集枸杞葉片,液氮處理后,保存于-80 ℃冰箱備用[13]。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取及cDNA測序文庫構建

采用天根生化科技有限公司(中國,北京)生產的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取寧夏枸杞葉片中的總RNA,構建cDNA測序文庫。

1.2.2 Illumina HiSeq測序及差異基因篩選

通過高通量Illumina HiSeq PE150測序平臺對已構建好的文庫進行測序并獲得原始數據。去除接頭序列、過濾掉低質(low quality,堿基質量值小于等于25的堿基數占整個reads 60%以上)和N(N表示無法確定堿基信息)比例大于5%的reads,獲得可用于后續分析的參考序列。將參考序列在Nr、Pfam、Swiss-prot、KEGG、GO數據庫進行blastx比對獲得基因功能注釋。采用DESeq2進行基因的差異表達分析,以|log2(αFC)| >1,且P< 0.05作為標準篩選苯丙烷代謝途徑相關的差異表達基因。

1.2.3 苯丙烷代謝途徑相關基因qRT-PCR分析

為了進一步驗證轉錄組數據的準確性,對苯丙烷代謝途徑相關重要基因進行qRT-PCR分析。參考寧夏枸杞轉錄組測序結果,運用Primer Premier 5.0設計引物(表1),使用諾唯贊生物科技有限公司(中國,南京)生產的試劑盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711-02)進行熒光定量檢測。PCR反應條件:預變性95 ℃孵育10 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火1 min,PCR循環數為40個,每個樣品重復3次,采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量。

表1 基因功能注釋及引物序列

1.2.4 鹽脅迫下寧夏枸杞苯丙烷代謝途徑關鍵酶活性測定

采用蘇州夢犀生物醫藥科技有限公司生產的試劑盒(中國,江蘇)對寧夏枸杞葉片苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、4-香豆酸CoA羧化酶(4CL)、二氫黃酮還原酶(DFR)和肉桂醇脫氫酶(CAD)的活性進行測定。

1.2.5 鹽脅迫下寧夏枸杞抗氧化酶活性鑒定

采用蘇州科銘生物技術有限公司生產的試劑盒(中國,江蘇)對寧夏枸杞葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的活性進行測定。

1.2.6 酚、類黃酮及木質素含量測定

采用蘇州夢犀生物醫藥科技有限公司生產的試劑盒(中國,江蘇)對寧夏枸杞葉片酚類、類黃酮和木質素含量進行測定。

1.3 數據處理

使用SPSS Statistics 26.0、Origin以及Excel對數據進行分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對寧夏枸杞幼苗的生長形態的影響

寧夏枸杞生長形態在鹽脅迫處理下發生明顯變化(圖1)。其中,隨著NaCl濃度的增加,寧夏枸杞幼苗株高呈先增加后下降趨勢,在100,200 mmol/L NaCl處理下明顯高于對照組,在300 mmol/L NaCl處理下比對照組顯著下降。同時,與0～200 mmol/L NaCl處理相比,寧夏枸杞幼苗在300 mmol/L NaCl處理下葉片數量減少,主根長度明顯降低,葉片萎蔫,部分葉片脫落。以上結果表明,寧夏枸杞生長的最適鹽濃度在100～200 mmol/L NaCl之間,300 mmol/L NaCl 明顯抑制其生長。

Ⅰ～Ⅳ分別為 0,100,200,300 mmol/L NaCl處理。下同。

2.2 鹽脅迫下寧夏枸杞苯丙烷代謝途徑相關基因差異表達分析

通過KEGG Pathway 顯著性富集分析對鹽脅迫下寧夏枸杞葉片中所有差異表達基因進行分析,共有58個基因被顯著富集于苯丙烷代謝途徑(P< 0.05);與對照相比,100,200,300 mmol/L NaCl脅迫處理下寧夏枸杞葉片中分別有30,32,29個苯丙烷代謝相關基因差異表達,其中3個處理組共有顯著差異表達基因7個(圖2),進一步分析表明100 mmol/L NaCl處理組中上調基因20個,下調基因10個;200 mmol/L NaCl處理組中上調基因17個,下調基因15個;300 mmol/L NaCl處理組中上調基因11個,下調基因18個。本研究重點對苯丙烷代謝途徑相關的15個關鍵基因的差異表達及其參與寧夏枸杞對鹽脅迫的響應進行討論(表2)。

圖2 鹽脅迫下寧夏枸杞葉片苯丙烷代謝途徑相關差異表達基因

表2 鹽脅迫下寧夏枸杞葉片苯丙烷代謝途徑主要差異表達基因

2.3 鹽脅迫下寧夏枸杞葉片苯丙烷代謝途徑相關基因qRT-PCR分析

運用qRT-PCR對寧夏枸杞葉片中酚類、類黃酮和木質素合成相關的5個基因(PAL、C4H、4CL、CCoAOMT和POD12)在不同濃度鹽脅迫下的表達模式進行分析。結果表明:隨著鹽濃度的增加,PAL表達量與對照相比均呈下降趨勢,且差異均達到顯著水平;C4H和4CL表達量呈先升后降的趨勢,但C4H和4CL表達量分別以100 mmol/L和200 mmol/L最高,且均顯著高于對照,其余處理均低于對照;POD12和CCoAOMT的表達量均隨鹽濃度的增加而先升后降,且各濃度處理均比對照顯著上調,并均在200 mmol/L NaCl處理下表達量最高(圖3,A)。

A. qRT-PCR分析; B. FPKM分析;數據以3次生物學重復的平均值±標準差表示。圖中組間標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

進一步與轉錄組測序得到的FPKM值進行比較,發現上述5個基因在不同鹽濃度下的表達水平和轉錄組測序的結果基本一致(圖3,B),說明轉錄組測序結果可靠。

2.4 鹽脅迫下寧夏枸杞葉片相關酶活性及酚、類黃酮和木質素含量分析

鹽脅迫下寧夏枸杞葉片抗氧化酶活性測定結果(圖4)顯示,與對照組相比,葉片SOD和POD活性在各處理組均顯著下調,但隨著鹽脅迫濃度升高,SOD活性逐漸上升,而POD活性逐漸下降,且處理間多差異顯著;同時,葉片CAT活性在200 mmol/L NaCl處理下無顯著變化,在100,300 mmol/L NaCl處理下均顯著低于對照。

圖4 鹽脅迫下寧夏枸杞葉片SOD、POD和CAT活性變化

同時,對不同濃度鹽脅迫下寧夏枸杞葉片苯丙烷代謝途徑中相關酶的活性進行測定。結果(圖5)顯示,與對照組相比,葉片PAL和CAD活性在100 mmol/L NaCl處理下均顯著上調,在200和300 mmol/L NaCl處理下均無顯著變化;葉片C4H活性在各濃度NaCl處理下均與對照無顯著差異,但100 mmol/L NaCl處理顯著高于200 mmol/L NaCl處理,而與300 mmol/L NaCl處理無顯著差異;葉片4CL和DFR活性均在100,200 mmol/L NaCl處理下均比對照顯著上調,而在300 mmol/L NaCl處理下均無顯著變化。

圖5 鹽脅迫下寧夏枸杞葉片PAL、C4H、4CL、DFR 和CAD活性變化

另外,對不同濃度鹽脅迫下寧夏枸杞葉片中酚類物質、類黃酮和木質素的含量進行測定。結果 (圖6) 顯示,寧夏枸杞葉片中酚類物質含量在100,300 mmol/L NaCl處理下均顯著高于對照,在200 mmol/L NaCl處理下顯著低于對照;而葉片類黃酮的含量在各處理組均顯著高于對照,并以100 mmol/L NaCl處理最高,且與其余處理差異顯著;葉片木質素含量在100 mmol/L NaCl處理下達到8.56 mg/g,并顯著高于對照,而在200和300 mmol/L NaCl處理下與對照組相比未發生顯著變化。

圖6 鹽脅迫下寧夏枸杞葉片酚、類黃酮和木質素含量

3 討 論

本研究通過KEGG pathway顯著性富集分析發現100～300 mmol/L NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片中共有58個苯丙烷代謝相關基因差異表達。該途徑合成的酚類、類黃酮和木質素等在植物適應環境脅迫中扮演著重要的角色,酚類和類黃酮可通過清除ROS避免膜質過氧化從而減少環境脅迫對植物造成的損傷[14],而木質素可通過提高細胞壁的強度使植物適應環境脅迫[15]。

3.1 寧夏枸杞通過提高酚類和類黃酮含量清除過量ROS適應鹽脅迫

酚類物質是重要的抗氧化物質[16],與植物耐鹽性密切相關。鹽脅迫下植物中PAL、C4H和4CL等基因的表達水平與酚類化合物積累相關[17-19]。本研究發現,寧夏枸杞葉片PAL基因表達量在鹽脅迫下與對照相比顯著下調,但PAL活性在100 mmol/L NaCl脅迫下顯著上調,這可能是由于PAL屬于多基因家族,不同物種中PAL基因種類和數目各有不同,因此對脅迫的響應也有所不同[20]。例如水稻中有8個PAL基因在鹽脅迫下顯著下調表達,而只有OsPAL3上調表達[21]。因此,寧夏枸杞中PAL家族可能也是由多個PAL基因構成的,所以在鹽脅迫下的表達模式也不同,PAL活性的提高可能是由其他PAL基因控制的。C4H是細胞色素P450的一種,催化反式肉桂酸生成對香豆酸。鹽脅迫下該基因的過表達有利于更多酚類物質的合成[22]。本研究中C4H表達量隨NaCl濃度的增加呈現先升后降的變化趨勢,與相應酶活性變化趨勢一致,均在100 mmol/L NaCl處理下達到最高,該基因可能是促進寧夏枸杞葉片酚類物質積累的重要基因。4CL可以催化香豆酸和CoA合成香豆酰CoA。在煙草中過表達4CL提高了其酚類物質的含量及抗旱性[23]。本研究發現寧夏枸杞葉片中該基因轉錄水平在鹽脅迫下呈先升后降的表達趨勢,相應酶活性也在100,200 mmol/L NaCl脅迫下顯著高于對照。值得注意的是,本研究中寧夏枸杞葉片酚類物質含量在100 mmol/L NaCl脅迫下顯著高于對照。以上結果表明在適度鹽脅迫下(100 mmol/L NaCl)寧夏枸杞可能通過調控苯丙烷代謝通路酚類合成關鍵酶基因的表達,積累酚類物質來清除過量ROS以適應鹽脅迫。

類黃酮可作為植物體內二級抗氧化系統,當減少ROS產生的第一道防線抗氧化酶系統發生變化時,類黃酮的生物合成會被觸發[24]。其通過提供電子或氫原子清除ROS[25],進而減少氧化脅迫對植物的傷害。在秋茄鹽脅迫研究中發現CHS基因的表達有利于類黃酮物質的積累[10]。在植物中過表達CHS、F3H和F3′5′H、DFR顯著提高了類黃酮的含量,增強了植物對鹽、干旱和氧化脅迫的耐受性[26-30]。本研究發現在100 mmol/L NaCl脅迫下寧夏枸杞葉片中抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性均顯著下調,表明此時它們清除ROS的能力下降;此時寧夏枸杞CHS、F3H、F3′5′H、DFR基因轉錄水平均呈上調表達的趨勢,DFR活性也顯著增加,類黃酮的含量明顯升高,這一結果表明在適度鹽脅迫下(100 mmol/L NaCl)寧夏枸杞葉片中的二級抗氧化系統類黃酮生物合成途徑被激活,提高了其抗氧化脅迫的能力。而在中高度鹽脅迫(200、300 mmol/L NaCl)下SOD和CAT的活性逐漸上調,類黃酮物質的含量相應減少,此時抗氧化酶系統和類黃酮物質一起協同清除ROS以適應鹽脅迫。

3.2 寧夏枸杞通過木質素積累增加細胞壁強度適應鹽脅迫

木質素是植物細胞次生壁的重要成分之一,在植物生長發育及抗逆性方面發揮重要作用[31],植物可通過調節細胞壁組分增加細胞壁強度來應對脅迫環境[32]。本研究發現在鹽脅迫下寧夏枸杞葉片中與木質素合成相關的基因表達顯著上調。CCoAOMT是木質素合成過程中的關鍵酶,參與木質素單體合成的甲基化反應,其基因表達水平與植物木質素含量密切相關[33]。逆境脅迫下該基因表達量的提高可能誘導木質素的迅速合成[34]。生姜CCoAOMT轉錄水平在中度NaCl脅迫下明顯升高,但在較高NaCl濃度下降低,與其木質素含量變化趨勢相同[35]。在本研究中,寧夏枸杞葉片中CCoAOMT基因也在100 mmol/L NaCl脅迫下顯著上調,此時木質素含量明顯上升,而隨NaCl濃度的增加該基因表達及木質素含量與對照組相比未發生顯著變化。CAD是催化各種肉桂醛生成木質素單體的關鍵酶。在非生物脅迫下CAD基因表達水平的增加可促進細胞壁木質化過程[36]。本研究發現鹽脅迫下寧夏枸杞葉片中CAD基因下調表達,但其酶活性在100 mmol/L NaCl處理下顯著上調,而且木質素含量較對照顯著升高。這可能是由于鹽脅迫導致基因發生翻譯后蛋白修飾,使酶活性與基因表達量不同步[37]。表明寧夏枸杞可能通過木質素合成途徑中關鍵基因差異表達以及酶蛋白翻譯后修飾等多種調控方式應答鹽脅迫。

綜上所述,在100 mmol/L適度鹽脅迫下,寧夏枸杞通過調控苯丙烷代謝途徑中相關基因的表達來增加酚類物質、類黃酮和木質素等次生代謝物質的積累,從而啟動非酶促抗氧化系統減緩ROS造成的傷害,并通過合成木質素增加細胞壁強度來協同適應鹽脅迫,這可能是寧夏枸杞適應鹽脅迫環境的一種重要特征。但在200,300 mmol/L的中高度鹽脅迫下,以上3類化合物的合成均明顯減弱,植株耐鹽性降低和生長受到抑制,因此認為寧夏枸杞生長最適鹽濃度在100～200 mmol/L NaCl之間,這與鹽脅迫下寧夏枸杞生長形態變化相一致。本研究結果為闡明苯丙烷代謝途徑相關基因、酶以及產物參與提高寧夏枸杞耐鹽性提供了理論依據,同時對寧夏枸杞的栽培生產具有重要指導意義。