‘沙糖橘’S蛋白同源基因CrSPH的克隆與表達(dá)分析

吳秀蘭,唐文武,徐呈祥,李桂花

(1 肇慶學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院,廣東肇慶 526061;2 肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,廣東肇慶 526061;3. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,廣州 510640)

在顯花植物中,自交不親和性(self-incompatibility,SI)被認(rèn)為是防止自花授粉、促進(jìn)異花授粉及產(chǎn)生新基因型的重要遺傳機(jī)制。SI是由1個(gè)單一的復(fù)等位基因S位點(diǎn)所控制,以實(shí)現(xiàn)接受還是排斥自我的花粉[1]。SI系統(tǒng)可分為孢子體SI(sporophytic SI,SSI)和配子體SI(gametophytic SI,GSI)。SSI和GSI由不同的S位點(diǎn)基因控制,以十字花科為代表的SSI 主要由S位點(diǎn)的SRK(S-receptor kinase)和SCR(S-locus protein 11)基因控制[2]。這2個(gè)緊密連鎖的S位點(diǎn)基因在柱頭的乳突細(xì)胞中特異性表達(dá),并在SI中控制柱頭的功能[3]。以茄科為代表的GSI主要由雌蕊中的S-RNase和花粉中SLF(S-locus F-box)/SFB(S-haplotype-spectific F-box)基因控制[4]。有關(guān)S-RNase研究較多,玄參科[5]、薔薇科[6]、蕓香科[7]、在茄科[8]等均有報(bào)道,不同S-RNase之間存在高度的多態(tài)性,其氨基酸序列的同源性介于38%～98%之間[9]。在花粉S位點(diǎn)基因研究方面,Lai等[10]從金魚草的BAC文庫(kù)中篩選到1個(gè)AhSLF-S2基因,該基因與S2-RNase緊密連鎖。Sassa等[11]在梨中鑒定了5個(gè)F-box基因,均位于Sn-RNase基因附近。Beecher等[12]報(bào)道除了關(guān)鍵S因子外,其他非關(guān)鍵因子也參與自交不親和反應(yīng),如PCD[13]、SSK1[14]、CrSKP1-e[15]、BrCML49[16]等。

柑橘屬于S-RNase介導(dǎo)的GSI,由花柱S-RNase和花粉SLF相互作用,通過抑制花粉管的生長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)自交不親和性[17]。當(dāng)花柱S-RNase進(jìn)入花粉管后,非自我S-RNase會(huì)被SLF識(shí)別并被泛素化及降解,花粉管能正常延伸至子房受精。當(dāng)自我S-RNase釋放到花粉管中,會(huì)降解花粉管中的RNA,使得花粉管無法在花柱中生長(zhǎng),表現(xiàn)出自交不親和反應(yīng)[18]。沙糖橘是中國(guó)重要的柑橘品種,屬于自交親和品種。‘無籽沙糖橘’是‘沙糖橘’的芽變體,屬于GSI[19-20],是研究自交不親和的理想材料。課題組前期從無籽沙糖橘SSH文庫(kù)中篩選到1個(gè)自交不親和相關(guān)的EST序列,序列比對(duì)為S-蛋白同源基因(S-protein homologous gene,SPH),柑橘SPH基因的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。本研究以甜橙(Citrussinensis)的SPH基因序列(Cs5g34580.1)為參照,克隆了‘沙糖橘’CrSPH基因的CDS和DNA序列,并分析其在花器官不同部位、授粉后不同時(shí)段的表達(dá)量,同時(shí)研究該蛋白對(duì)‘無籽沙糖橘’、‘沙糖橘’花粉萌發(fā)率的影響,以期為研究CrSPH基因功能及在柑橘自交不親和反應(yīng)中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用‘無籽沙糖橘’及‘沙糖橘’果樹由肇慶市德慶縣馬圩鎮(zhèn)果園提供,為7年生果樹。于2019年春季收集含苞待放花蕾,用鑷子剝離出花瓣、花絲、柱頭、花柱、子房、花絲和花藥,液氮速凍后置于-80 ℃冰箱,用于不同組織表達(dá)分析。收集自交(‘無籽沙糖橘’ב無籽沙糖橘’)、異交(‘無籽沙糖橘’ב沙糖橘’)后0,1,2,3,4,5,6,7 d的雌蕊,液氮速凍后置于-80 ℃冰箱,用于授粉后不同時(shí)段的表達(dá)分析。收集‘無籽沙糖橘’和‘沙糖橘’花粉,置于-20 ℃冰箱保存,用于體外花粉萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1CrSPH基因克隆

采用RNA提取試劑盒提取總RNA,采用CTAB法[21]提取基因組DNA,采用Life Technology公司生產(chǎn)的M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。參考甜橙SPH基因序列(Cs5g34580.1)設(shè)計(jì)1對(duì)包含起始密碼子和終止密碼子的引物CrSPH-F/R(表1),擴(kuò)增CrSPH基因的CDS和DNA序列,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳并回收,獲得目的基因片段。將目的基因與pMD19-T克隆載體連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,經(jīng)37 ℃過夜培養(yǎng)后,挑取3個(gè)陽(yáng)性菌落經(jīng)PCR鑒定正確后,送基因測(cè)序公司測(cè)序驗(yàn)證。

表1 所用引物序列

利用 NCBI的blastp 對(duì)CrSPH基因序列和蛋白序列進(jìn)行分析,采用ProtParam在線工具分析蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)及分子量。利用在線軟件SignalP 6.0對(duì)CrSPH蛋白進(jìn)行信號(hào)肽分析。

1.2.2 qPCR表達(dá)分析

為分析CrSPH基因在花器官的不同部位及授粉后不同時(shí)段的表達(dá)量,利用qPCR技術(shù)檢測(cè)花瓣、子房、花柱、柱頭、花絲和花藥等花器官,以及自交(‘無籽沙糖橘’ב無籽沙糖橘’)、異交(‘無籽沙糖橘’ב沙糖橘’)授粉后不同時(shí)段的基因表達(dá)量。根據(jù)CrSPH基因和柑橘Actin基因序列,分別設(shè)計(jì)符合qPCR要求的特異引物(qCrSPH-F/R)和內(nèi)參引物(Actin-F/R)(表1),按照qPCR試劑盒(SYBR Green)說明書進(jìn)行qPCR反應(yīng),反應(yīng)體系為20.0 μL,包括10.0 μL SYBR ExTaq,10 μmol/L引物各1.0 μL,6.0 μL ddH2O和2.0 μL(80 ng) cDNA,擴(kuò)增反應(yīng)在ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行。設(shè)置3次重復(fù),每次用ddH2O做陰性對(duì)照,數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT法計(jì)算[22]。

1.2.3 Southern雜交分析

以10.0 μg基因組DNA為模板,分別用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、ScaⅠ、ClaⅠ于37 ℃過夜消化,全部酶切產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠電泳3～5 h,待全部產(chǎn)物分離后凝膠成像系統(tǒng)拍照,將其轉(zhuǎn)入Hybond N+尼龍雜交膜。根據(jù)PCR DIG探針合成試劑盒說明書合成帶有DIG標(biāo)記的探針,于42 ℃預(yù)雜交2 h后,加入制作好的探針過夜雜交;然后用2×檸檬酸鈉(stand saline citrate,SSC)溶液(含0.1% SDS),再用0.5×SSC(含0.1% SDS)于65 ℃洗脫2次,每次洗脫10 min;最后于暗室中將X-ray膠片平鋪到雜交膜并置于暗匣中,于37 ℃曝光5～30 min。

1.2.4 原核表達(dá)載體構(gòu)建及CrSPH蛋白誘導(dǎo)

設(shè)計(jì)含有BamH I和SalI酶切位點(diǎn)的引物pET32a-CrSPH-F/R(表1),以pMD19-CrSPH為模板擴(kuò)增目的基因,獲得帶有黏性末端的目的基因。用BamH I和SalI雙酶切線性化原核表達(dá)載體pET32a,將帶有黏性末端的目的基因與線性化的表達(dá)載體用T4DNA酶連接,經(jīng)轉(zhuǎn)化、鑒定后獲得pET32a-CrSPH重組原核表達(dá)載體。將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸表達(dá)菌株BL21(DE3),以空質(zhì)粒為對(duì)照。用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)菌株表達(dá)獲得pET32a-CrSPH融合蛋白,并經(jīng)12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.5 花粉萌發(fā)實(shí)驗(yàn)

將原核誘導(dǎo)的CrSPH蛋白稀釋成0.4,0.8,1.6,3.2,6.4 μg/μL 5個(gè)濃度。花粉培養(yǎng)基配制按照Miao等[26]的方法,分別取上述各濃度的‘無籽沙糖橘’和‘沙糖橘’CrSPH蛋白200 μL,加入到上述花粉培養(yǎng)基后分成2份:一份用于‘無籽沙糖橘’花粉培養(yǎng),一份用于‘沙糖橘’花粉培養(yǎng)。相應(yīng)花粉撒播至培養(yǎng)基后于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)10 h,以花粉管長(zhǎng)度超過花粉粒直徑作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn),在光學(xué)顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)各處理的花粉萌發(fā)率,設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù),以未添加CrSPH蛋白組作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 CrSPH基因克隆

以‘無籽沙糖橘’和‘沙糖橘’的花蕾 cDNA 為模板,利用引物CrSPH-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均得到約400 bp特異條帶(圖1),經(jīng)回收、克隆后測(cè)序表明‘無籽沙糖橘’和‘沙糖橘’CDS均為417 bp,編碼138個(gè)氨基酸。兩者間序列存在3個(gè)堿基差異,‘沙糖橘’第93位C突變?yōu)門、第190位G突變?yōu)锳、第324位C突變G,從而導(dǎo)致‘沙糖橘’第64位纈氨酸(V)突變?yōu)楫惲涟彼?I),108位天冬酰胺(N)突變?yōu)橘嚢彼?K)(圖2)。利用CrSPH-F/R引物對(duì)2個(gè)材料的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序,其序列長(zhǎng)度也是417 bp,表明‘沙糖橘’和‘無籽沙糖橘’基因組DNA均不含內(nèi)含子。利用ProtParam預(yù)測(cè)‘沙糖橘’CrSPH蛋白顯示其分子量為16.05 kD,理論等電點(diǎn)為8.48,SignalP 6.0分析顯示該蛋白不存在信號(hào)肽。

M. Marker; 1. Wuzishatangju; 2. Shatangju.

STJ. Shatangju; WZSTJ. Wuzishatangju.

2.2 不同部位花器官的基因表達(dá)分析

采用qPCR技術(shù)對(duì)花瓣、花絲、花藥、柱頭、花柱和子房等花器官部位的CrSPH基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖3所示,CrSPH基因在‘沙糖橘’花器官不同部位的表達(dá)量差異較大,其中子房組織的表達(dá)量最高,且與其他部位表達(dá)量差異均達(dá)到顯著水平;‘無籽沙糖橘’不同部位的表達(dá)量差異均未達(dá)到顯著水平。在高表達(dá)的子房中,‘沙糖橘’表達(dá)量是‘無籽沙糖橘’的16倍,表明CrSPH基因在‘沙糖橘’中具有高度的組織表達(dá)特異性。

柱狀圖上不同小寫字母表示花器官不同部位表達(dá)量差異顯著(P<0.05)。

2.3 自交和異交授粉后不同時(shí)段的基因表達(dá)分析

利用qPCR檢測(cè)了CrSPH基因在自交(‘無籽沙糖橘’ב無籽沙糖橘’)和異交(‘無籽沙糖橘’ב沙糖橘’)授粉后0,1,2,3,4,5,6,7 d的雌蕊組織表達(dá)量,相關(guān)結(jié)果見圖4。由圖4可知,異交授粉后第6,7天的表達(dá)量最高,與其他時(shí)段的差異均達(dá)到顯著水平;異交授粉后第2～4天的表達(dá)量較高,與表達(dá)量較低的第1和第5天的差異達(dá)到顯著水平,異交授粉第6天表達(dá)量是第1天表達(dá)量的12.4倍,表明CrSPH基因在異交授粉后不同時(shí)段的表達(dá)量差異顯著。

柱狀圖上不同小寫字母表示授粉后不同時(shí)間的表達(dá)量差異顯著(P<0.05)。

由圖4可知,自交授粉后各時(shí)段的基因表達(dá)水平較低,其表達(dá)量呈現(xiàn)出先上升后下降的表達(dá)規(guī)律,以第3天的表達(dá)量最高,但不同時(shí)段的基因表達(dá)量差異未達(dá)到顯著水平。

2.4 Southern 雜交分析

利用CrSPH基因內(nèi)部不存在酶切位點(diǎn)的EcoR I和SacI酶以及存在1個(gè)酶切位點(diǎn)的ClaI酶對(duì)基因組DNA消化后,與DIG標(biāo)記CrSPH基因的探針進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn),結(jié)果見圖5。由圖5可知,經(jīng)EcoR I和SacI消化的DNA雜交出1條雜交帶,而經(jīng)ClaI酶消化的DNA出現(xiàn)2條雜交帶,表明CrSPH基因在‘無籽沙糖橘’和‘沙糖橘’基因組中均以單拷貝形式存在。

A.‘Wuzishatangju’, B. ‘Shatangju’.

2.5 CrSPH蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及對(duì)離體花粉萌發(fā)影響

將線性化的pET32a表達(dá)載體與帶有BamH I和SalI酶切位點(diǎn)的目的基因連接后,經(jīng)轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、測(cè)序鑒定后,成功構(gòu)建含有CrSPH基因的原核表達(dá)載體pET32a-CrSPH。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖6。由圖6可知,原核誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白條帶約37 kD,其中CK中的標(biāo)簽蛋白為21 kD,誘導(dǎo)獲得的CrSPH蛋白約為16 kD,這與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的16.05 kD結(jié)果相吻合,表明該原核表達(dá)系統(tǒng)成功誘導(dǎo)表達(dá)出CrSPH蛋白。

M. Marker; CK. His tags protein; 1. ‘Wuzishatangju’;2. ‘Shtangju’.

將上述異源表達(dá)的CrSPH蛋白稀釋成0.4,0.8,1.6,3.2,6.4 μg/μL濃度后添加到花粉培養(yǎng)基,觀察其對(duì)花粉萌發(fā)率的影響,并以不添加外源CrSPH蛋白組為對(duì)照,結(jié)果見圖7。由圖7可知,‘無籽沙糖橘’CrSPH蛋白對(duì)2種花粉萌發(fā)率有一定影響,隨著異源‘無籽沙糖橘’CrSPH蛋白濃度增加,‘無籽沙糖橘’花粉萌發(fā)率顯著性降低;但‘沙糖橘’花粉在0.4,1.6 μg/μL的低濃度處理時(shí)萌發(fā)率較高,而在3.2,6.4 μg/μL的高濃度處理下萌發(fā)率反而下降。‘沙糖橘’CrSPH蛋白對(duì)‘無籽沙糖橘’和‘沙糖橘’的花粉萌發(fā)均無明顯影響。

圖柱上不同字母表示不同濃度處理下的差異顯著性(P<0.05),*表示兩材料間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05),**表示兩材料間差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。

3 討 論

多數(shù)果樹屬于配子體自交不親和,其自交不親和性是雌蕊關(guān)鍵因子S-RNase基因和花粉關(guān)鍵因子SLF/SFB基因相互作用結(jié)果[7,17,23-25]。Lai等[10]在研究金魚草花粉自交不親和反應(yīng)中,將金魚草花粉特異表達(dá)AhSLF-S2基因和雌蕊特異表達(dá)的AhS2-RNase基因轉(zhuǎn)入矮牽牛(Petuniahybrida),結(jié)果分別在轉(zhuǎn)基因矮牽牛的花粉和雌蕊中檢測(cè)這兩個(gè)基因的表達(dá)量,Qiao等[26]進(jìn)一步通過花粉實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)了AhSLF-S2和AhS2-RNase基因的矮牽牛由SI轉(zhuǎn)變成SC。然而薔薇科花粉自交不親和反應(yīng)并非由于基因表達(dá)量差異導(dǎo)致,而是花粉S基因編碼區(qū)發(fā)生了堿基的替換、缺失,導(dǎo)致S蛋白發(fā)生改變,從而導(dǎo)致由SI向SC轉(zhuǎn)變[27]。Sassa等[4]發(fā)現(xiàn)SC突變體‘Osa-Nijisseiki’是由于SI日本梨‘Nijisseiki’的S4-RNase基因發(fā)生了突變,使得S4-RNase基因不能在花柱表達(dá),導(dǎo)致SI向SC突變。Ushijima等[28]在梅(Prunusmume)中獲得花粉突變?cè)斐傻淖越挥H和單體型Sf,Sf基因結(jié)構(gòu)中有6.8 kbp堿基插入,造成編碼的F-box蛋白缺少了C-端序列,從而造成親和突變。本研究中,CrSPH基因在‘沙糖橘’和‘無籽沙糖橘’CDS序列存3個(gè)堿基的差異(C→T,G→A,C→G),導(dǎo)致2個(gè)氨基酸殘基發(fā)生改變(V→I,N→K)。在CrSPH基因在特異性表達(dá)的子房部位,‘沙糖橘’表達(dá)量是‘無籽沙糖橘’的16倍,推測(cè)‘無籽沙糖橘’的CrSPH基因突變和子房中低水平表達(dá)可能與其自交不親和表型相關(guān)。

植物自交不親和主要由1個(gè)單一的復(fù)等位基因S位點(diǎn)控制,該基因座上存在2個(gè)緊密連鎖且分別在花柱和花粉中特異表達(dá)的基因,分別是雌蕊決定因子S-RNase和花粉決定因子SLF/SFB。柑橘屬于S-RNase介導(dǎo)的GSI,主要通過抑制花粉管的生長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)自交不親和性,因此S位點(diǎn)蛋白在花粉萌發(fā)和抑制花粉管生長(zhǎng)中起著重要的作用[17]。Zhang等[18]提出泛素蛋白降解和液泡分揀途徑假說,認(rèn)為S-RNase通過細(xì)胞內(nèi)吞作用從細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)入到花粉管后被運(yùn)輸?shù)交ǚ鄣囊号葜?在異花授粉的花粉管中,液泡膜未被破壞,S-RNase會(huì)被SCFCLF泛素化而降解,花粉管正常延伸;而自花授粉后,液泡膜由于某種機(jī)制會(huì)被破壞,S-RNase便釋放到細(xì)胞質(zhì)中,產(chǎn)生細(xì)胞毒素效應(yīng)從而抑制自花花粉管的生長(zhǎng)。SI除了雌蕊決定因子S-RNase和花粉決定因子SLF外,其他非S因子也參與自交不親和反應(yīng)。Beecher等[12]等發(fā)現(xiàn)通過轉(zhuǎn)化單一的S-RNase基因不一定能夠使自交親和的煙草品種恢復(fù)拒斥自花花粉的能力,說明SI除了花粉和花柱S決定因子外,其他非關(guān)鍵因子也參與自交不親和反應(yīng)。Goldraij等[29]報(bào)道了HT-B作為非S因子可使不親和花粉管中的液泡破裂,使得S-RNase酶從液泡中釋放出來,從而抑制了花粉管生長(zhǎng)。Thomas等[13]報(bào)道了PCD等非S因子不參與花粉管生長(zhǎng)尖端的生長(zhǎng)抑制,可能參與SI下游事件來保證花粉管生長(zhǎng)抑制的不可逆性。Ren等[15]從無籽沙糖橘中克隆到1個(gè)CrSKP1-e基因,在花粉中特異表達(dá),是SSK1基因的同源基因并參與SI反應(yīng)。本研究中,CrSPH作為S位點(diǎn)蛋白的同源基因,CrSPH蛋白對(duì)花粉萌發(fā)表型效應(yīng)也有顯著影響,隨著‘無籽沙糖橘’CrSPH蛋白濃度增加,‘無籽沙糖橘’花粉萌發(fā)率顯著性降低;而‘沙糖橘’花粉在低濃度CrSPH蛋白處理時(shí)萌發(fā)率較高,在高濃度處理時(shí)萌發(fā)率下降,因此,筆者推測(cè)CrSPH蛋白作為非關(guān)鍵因子,可能通過參與花粉管液泡破裂或其他下游代謝過程參與柑橘SI反應(yīng)過程,但具體如何作用,需要進(jìn)一步遺傳研究和功能驗(yàn)證。