靜脈注射咪達唑侖對蛛網膜下腔出血大鼠腦神經炎癥和損傷的改善作用及其機制

孟元元，劉艷，張華強，周民，姚玲玲

1 武漢科技大學附屬普仁醫院麻醉科，武漢430000；2 湖北文理學院附屬醫院 襄陽市中心醫院疼痛科

研究表明，蛛網膜下腔出血（SAH）發病后72 h內發生的早期腦損傷是導致患者高病死率和高致殘率的主要原因，其發生與多種病理機制相關，而神經炎癥被認為在SAH后早期腦損傷中發揮重要作用［1-2］。環腺苷酸（cAMP）作為重要的第二信使，介導許多細胞內信號級聯反應，包括蛋白激酶A（PKA）/環腺苷酸應答元件結合蛋白（CREB）信號通路。動物實驗表明，cAMP/PKA/CREB信號通路與抑郁癥及認知功能障礙的發病機制密切相關［3］。已有研究發現，TGR5激動劑INT-777通過激活cAMP/PKA信號通路減弱SAH發病后腦損傷中神經炎癥，改善SAH后的短期神經行為功能［4］。咪達唑侖（MDZ）作為一種常用的麻醉劑，具有水溶性、起效快、作用時間短等特點，并對人腦的神經基礎產生藥理學作用［5］，但目前尚無研究報道MDZ對SAH發病后的神經保護作用。2022年3月—12月，我們對SAH大鼠給予MDZ進行干預，觀察其對神經炎癥的影響，探討其作用機制與cAMP/PKA/CREB信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡健康雄性Wistar大鼠65只，體質量280～320 g，購自廣州檢驗檢測認證集團有限公司，許可證號：SYXK（粵）2022-0299。飼養條件：室溫（22 ± 1）℃，濕度60% ± 5%，12 h晝夜循環。自由飲食飲水。本研究經動物護理和使用委員會批準，并按照《實驗動物護理和使用指南》進行。

1.1.2 主要試劑與儀器 MDZ購自浙江恩華藥業股份有限公司；PKA抑制劑H-89購自美國MedChemexpress公司；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、IL-6蛋白質提取試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；ECL試劑購自美國Amersham Biosciences公司；cAMP、p-PKA、p-CREB、PKA、CREB一抗購自英國Abcam公司。Synergy LX多功能酶標儀購自美國BioTek公司；BX61光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 動物分組與SAH模型制備 將大鼠隨機分為假手術組10只和造模組55只，參照文獻［6］方法制備SAH模型。腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，俯臥位固定。在枕外隆凸附近切開，剪開淺層肌肉，顯露頸夾肌間隙，對環枕膜、枕骨進行初步定位。抽取股動脈血3.5 mL，在2 min內注入枕大池，注入后保持30°低頭30 min，使血液沉積在腦底血管。間隔48 h后，同樣方法抽取另一側股動脈血注入枕大池。當觀察到大鼠腦底基底池部位有明顯的血液存在，并有腦脊液漏出，表明SAH造模成功。假手術組進行上述同樣操作，向枕大池注入等體積生理鹽水。

1.3 藥物干預方法 取SAH造模成功的50只大鼠，隨機分為SAH組、MDZ低劑量組、MDZ中劑量組、MDZ高劑量組、MDZ高劑量+H-89組，每組各10只。MDZ高、中、低劑量組分別經頸靜脈注射0.30、0.15、0.05 mg/kg MDZ，同時腹腔注射等體積生理鹽水；MDZ高劑量+H-89組經頸靜脈注射0.3 mg/kg MDZ，同時腹腔注射5 mg/kg H-89；SAH組、假手術組頸靜脈及腹腔注射等體積生理鹽水。每天1次，連續3 d。

1.4 神經功能評估 末次給藥2 h后，參照改良的Garcia神經功能評分系統［7］，從自主活動、四肢運動對稱性、前肢伸展、攀爬抓握、雙側軀干觸覺反應、觸角反應6個方面評估各組大鼠的神經功能，最低3分，最高18分，評分越低表示神經功能損傷越嚴重。

1.5 血清炎癥因子檢測 采用ELISA法。采集大鼠靜脈血，使用ELISA試劑盒檢測IL-1β、TNF-α、IL-6含量，具體步驟按照試劑盒說明。

1.6 腦含水量檢測 采用干/濕法。各組隨機取3只大鼠，在深度麻醉下將大鼠斬首，摘除大腦，取出同側腦組織，立即使用電子天平稱取濕重。將腦組織置于100 ℃恒溫烘箱中48 h至恒重，使用電子天平稱取干重。以（濕重－干重）/濕重×100%計算腦含水量。

1.7 SAH等級評分 取各組剩余的7只大鼠，對大腦基底表面的6個區域進行SAH等級評估。0級：無蛛網膜下腔血液；1級：少量蛛網膜下腔血液；2級：具有肉眼可見的中度血塊；3級：血塊阻塞了所有動脈。

1.8 腦組織形態學觀察 采用HE染色。SAH等級評分結束后，取部分海馬區腦組織，加入4%多聚甲醛固定，脫水、石蠟包埋、切成4 μm厚的切片。石蠟切片脫蠟、復水、蘇木精染色60 s，1%鹽酸乙醇染色3 s，最后伊紅染色1 min。使用中性樹膠將切片密封到載玻片上，光學顯微鏡400倍視野下觀察組織形態學損傷情況。

1.9 腦組織cAMP/PKA/CREB通路相關蛋白檢測 采用Western blotting法。取剩余部分腦組織，使用蛋白質提取試劑盒提取蛋白質。通過SDSPAGE分離樣品中的蛋白質，濕轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，4 ℃下與cAMP、p-PKA、p-CREB、PKA、CREB一抗（稀釋濃度均為1∶1 000）孵育24 h。用Tris緩沖鹽水洗滌后，加入二抗，室溫孵育1 h。加入ECL試劑使印跡條帶可視化，用Image J軟件進行定量分析。

1.10 統計學方法 采用SPSS27.0統計軟件。數據分布的正態性通過Kolmogorov-Smirnov檢驗進行分析，呈正態分布的計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能評分比較 假手術組、SAH組、MDZ低劑量組、MDZ中劑量組、MDZ高劑量組、MDZ高劑量+H-89組神經功能評分分別為（21.23 ±2.14）、（5.55 ± 0.56）、（8.92 ± 0.90）、（14.24 ±1.44）、（18.42 ± 1.85）、（9.25 ± 0.93）分。與假手術組比較，SAH組神經功能評分降低（P＜0.05）；與SAH組比較，MDZ低、中、高劑量組評分均升高，其中高劑量組高于中、低劑量組，中劑量組高于低劑量組（P均＜0.05）；MDZ高劑量+H-89組評分較MDZ高劑量組降低（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平比較與假手術組比較，SAH組血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平升高（P均＜0.05）；與SAH組比較，MDZ低、中、高劑量組IL-1β、TNF-α、IL-6水平降低，且高劑量組低于中、低劑量組，中劑量組低于低劑量組（P均＜0.05）；MDZ高劑量+H-89組血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平較MDZ高劑量組升高（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（ng/mL，）

表1 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（ng/mL，）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與SAH組比較，bP＜0.05；與MDZ低劑量組比較，cP＜0.05；與MDZ中劑量組比較，dP＜0.05；與MDZ高劑量組比較，eP＜0.05。

TNF-α 0.72 ± 0.08 6.72 ± 0.68a 4.21 ± 0.43b 2.16 ± 0.23bc 1.15 ± 0.12bcd 4.33 ± 0.45e組別假手術組SAH組MDZ低劑量組MDZ中劑量組MDZ高劑量組MDZ高劑量+H-89組n 10 10 10 10 10 10 IL-1β 0.88 ± 0.09 6.82 ± 0.69a 4.62 ± 0.47b 2.55 ± 0.26bc 1.04 ± 0.11bcd 4.72 ± 0.48e IL-6 0.38 ± 0.04 42.15 ± 4.23a 27.82 ± 2.79b 12.35 ± 1.24bc 4.62 ± 0.48bcd 25.46 ± 2.55e

2.3 各組大鼠腦含水量比較 假手術組、SAH組、MDZ低劑量組、MDZ中劑量組、MDZ高劑量組、MDZ高劑量+H-89組腦含水量分別為58.15% ± 2.06%、82.77% ± 3.11%、72.88% ± 2.61%、67.88% ±2.39%、60.21% ± 2.09%、76.08% ± 2.47%。與假手術組比較，SAH組腦含水量升高（P＜0.05）；與SAH組比較，MDZ低、中、高劑量組腦含水量降低，且高劑量組低于中、低劑量組，中劑量組低于低劑量組（P均＜0.05）；MDZ高劑量+H-89組腦含水量較MDZ高劑量組增加（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠SAH等級評分比較 假手術組、SAH組、MDZ低劑量組、MDZ中劑量組、MDZ高劑量組、MDZ高劑量+H-89組大鼠SAH等級評分分別為（0.00 ± 0.00）、（17.11 ± 1.72）、（11.34 ± 1.14）、（7.24 ± 0.73）、（4.26 ± 0.43）、（11.83 ± 1.19）分。與假手術組比較，SAH組評分升高（P＜0.05）；與SAH組比較，MDZ低、中、高劑量組評分均降低，且高劑量組低于中、低劑量組，中劑量組低于低劑量組（P均＜0.05）；MDZ高劑量+H-89組評分較MDZ高劑量組增加（P＜0.05）。

2.5 各組大鼠腦組織海馬區形態學變化 假手術組海馬組織神經細胞排列整齊，結構正常；SAH組神經元細胞核碎裂，出現細胞壞死現象，MDZ低劑量組、MDZ中劑量組、MDZ高劑量組神經元細胞損傷逐漸減輕，MDZ高劑量組趨于正常化；MDZ高劑量+H-89組較MDZ高劑量組神經元細胞損傷加重。見OSID碼圖1。

2.6 各組大鼠腦組織cAMP/PKA/CREB通路相關蛋白表達水平比較 SAH組cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB表達水平較假手術組降低（P均＜0.05）；MDZ低、中、高劑量組較SAH組增加（P均＜0.05）；MDZ高劑量+H-89組較MDZ高劑量降低（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腦組織cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表達比較（）

表2 各組大鼠腦組織cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表達比較（）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與SAH組比較，bP＜0.05；與MDZ低劑量組比較，cP＜0.05；與MDZ中劑量組比較，dP＜0.05；與MDZ高劑量組比較，eP＜0.05。

p-CREB/CREB 0.94 ± 0.10 0.11 ± 0.02a 0.33 ± 0.04b 0.65 ± 0.07bc 0.89 ± 0.10bcd 0.36 ± 0.04e組別p-PKA/PKA假手術組SAH組MDZ低劑量組MDZ中劑量組MDZ高劑量組MDZ高劑量+H-89組n7 7 7 7 7 7 cAMP/β-actin 1.08 ± 0.11 0.25 ± 0.03a 0.44 ± 0.05b 0.69 ± 0.07bc 0.93 ± 0.10bcd 0.43 ± 0.05e 0.99 ± 0.10 0.18 ± 0.02a 0.39 ± 0.04b 0.62 ± 0.07bc 0.92 ± 0.10bcd 0.38 ± 0.04e

3 討論

早期腦損傷是SAH后不良結局的主要原因，包括SAH后腦水腫、血腦屏障破壞、神經細胞的凋亡等病理變化［8］。神經炎癥是SAH誘導的早期腦損傷中關鍵的病理過程之一［9］。研究顯示，抑制神經炎癥可減輕大鼠SAH后的腦水腫和神經元損傷，緩解早期腦損傷，進而改善SAH的預后［10-11］。因此，在SAH的情況下，針對神經炎癥的治療將減弱早期腦損傷并有利于改善神經系統預后。MDZ是一種苯二氮?類藥物，主要通過苯二氮?受體作用于腦干和邊緣系統，屬于新型神經毒劑抗驚厥藥。除了抗癲癇作用外，MDZ還具有抗炎作用，可以抑制神經炎癥因子釋放［12］。研究發現，MDZ可通過減少BV-3小膠質細胞中的NLRP3炎癥小體活化和促炎細胞因子釋放來發揮神經保護作用［13］。TANG等［14］報道，MDZ對缺氧/復氧引起的腦損傷具有神經保護作用。此外，臨床研究顯示，咪達唑侖聯合芬太尼的鎮靜鎮痛能夠改善重癥SAH患者的腦代謝，具有較好的治療效果［15］。二次枕大池注血是目前構建SAH模型較為理想且最為認可的造模方式，具有操作簡單、成功率高、動物病死率低等優點。腦水腫是SAH后的重要早期病理生理改變，也是導致SAH患者神經功能障礙的重要因素；神經炎癥反應可導致神經元細胞功能損傷和線粒體功能異常，是SAH后腦水腫發生發展的關鍵機制。本研究采用二次枕大池注血法構建SAH大鼠模型，通過Garcia評分、腦含水量、SAH等級評分等評估MDZ對大鼠神經功能及早期腦損傷的影響。結果顯示，SAH大鼠神經功能評分降低，腦含水量、SAH等級評分以及神經炎癥因子均增加，表明SAH大鼠神經功能受損；MDZ干預能夠降低SAH大鼠腦含水量、SAH等級評分以及神經炎癥因子水平，減輕SAH后的神經功能損傷，改善腦水腫，表明MDZ是一種有效的抗SAH后早期腦損傷的神經保護藥物。

cAMP作為重要的第二信使，參與學習記憶過程和突觸長期可塑性的改變；CREB是cAMP胞核內核蛋白，海馬區磷酸化的CREB是調節中樞神經系統的重要核內轉錄因子，具有多種生物學功能，包括參與調節學習、記憶能力、改善認知功能等，是多種信號轉導通路的關鍵調節成分［16］。CREB主要對PKA等信號發生應答反應，cAMP激活PKA后，活化的PKA進入細胞核，可磷酸化激活CREB［17］。JIN等［18］報道，在膿毒癥大鼠模型中，激活cAMP/PKA/CREB信號軸可通過減少海馬體內小膠質細胞的數量、中性粒細胞浸潤和炎癥因子（如IL-1β、IL-6和TNF-α）的表達，抑制神經炎癥來預防認知障礙。XIN等［19］報道，抑制SAH后的cAMP-CREB途徑可誘導少突膠質細胞分化和髓磷脂損傷。HU等［4］報道，在SAH大鼠模型中，INT-777可通過激活cAMP/PKA信號通路，抑制神經炎癥，減輕腦水腫和SAH后的神經功能缺損；而PKA抑制劑H-89可逆轉INT-777對SAH后神經行為結局的神經保護作用。以上研究表明cAMP/PKA/CREB通路是改善SAH后腦損傷和神經功能障礙的重要治療靶點。本研究結果顯示，SAH后大鼠腦組織cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB表達顯著下降，說明cAMP/PKA/CREB信號通路被抑制；伴隨著神經炎癥因子水平IL-1β、TNF-α、IL-6和腦組織含水量的增加以及嚴重的神經元損傷，再次證實cAMP/PKA/CREB信號通路抑制與SAH后早期腦損傷的發生發展有關。給予不同劑量MDZ干預后，大鼠海馬組織中cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB表達上調，神經炎癥因子水平降低，神經元損傷得到緩解，推測MDZ可以通過激活cAMP/PKA/CREB通路抑制炎癥反應，改善SAH大鼠神經元損傷。為驗證該實驗推測，本研究在MDZ干預的基礎上應用PKA抑制劑H-89進行實驗，結果發現H-89明顯減弱了MDZ對SAH大鼠的神經保護作用，提示MDZ抑制神經炎癥、緩解早期腦損傷的作用可能是通過激活cAMP/PKA/CREB通路實現的。

綜上所述，MDZ能夠抑制神經炎癥，減輕SAH大鼠早期腦損傷，改善其神經功能，其機制可能與激活cAMP/PKA/CREB通路有關。本研究僅從動物水平進行了初步探究，后續可考慮從體外細胞水平進行深入研究。此外，SAH的發病機制復雜，MDZ能否通過其他信號通路對SAH發揮神經保護作用仍需進一步探討。