文蛤MmASS基因克隆及生物信息學分析

陳素華,陳愛華*,吳楊平,張 雨,曹 奕,張志東,孫雪峰,朱艷青

(1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所,江蘇 南通 226007;2.南京師范大學 海洋科學與工程學院, 南京 201123)

精氨酸琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthetase, ASS)能在ATP作用下催化瓜氨酸(L-Citrulline)和天冬氨酸(L-Aspartate)形成精氨琥珀酸(Argininosuccinate),該產(chǎn)物經(jīng)精氨琥珀酸裂解酶(Argininosuccinate lyase, ASL)裂解形成精氨酸(L-Arginine)和延胡索酸(L-Fumarate);其中精氨酸能被精氨酸酶(Arginase)水解生成尿素(Urea),也可與一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)反應生成一氧化氮(Nitric oxide, NO)和瓜氨酸[1-2]。ASS是生成精氨酸、尿素和一氧化氮的關鍵限速酶,研究報道ASS調控產(chǎn)生的這些產(chǎn)物與生物體的免疫功能息息相關,可增強生物體細胞的殺菌和吞噬能力,提高免疫球蛋白含量,從而起到提高生物體自身免疫功能的作用[3-4]。

在人體中,ASS基因受到炎癥因子、激素等因素的刺激后,其轉錄水平會發(fā)生明顯的變化進而影響其他生理功能,ASS基因已成為癌癥、腫瘤等疾病個體化治療研究的新靶點,是醫(yī)療研究的熱點[5-8];植物中僅見棉花(Gossypiumhirsutum)ASS1基因的克隆與鑒定,研究證明該基因具有調控植物的生長和耐鹽的能力[9];干酵母(Yeast)和大腸桿菌(Escherichiacoli)等菌類中也有ASS基因的相關報道[10-11];水產(chǎn)動物中,ASS基因的相關研究很少,僅見非洲肺魚(Protopterusannectens)中有報道,Chng等[12]克隆獲得了非洲肺魚ASS基因的全長序列,研究分析了該基因結構特征和功能,證明非洲肺魚在高溫、缺水的夏眠期,該基因在肝臟、腎臟、腦、骨骼肌等各組織中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。ASS基因的下游基因精氨酸酶基因(Arg)及下游產(chǎn)物精氨酸卻是水產(chǎn)動物研究的熱點,Arg基因參與魚類抗感染免疫應答過程[13-15];精氨酸作為功能性氨基酸,具有促進魚體生長、改善免疫系統(tǒng)及腸道功能的作用,飼料中添加一定水平的精氨酸有利于魚類的健康養(yǎng)殖[16-17]。ASS處于Arg合成代謝的中心地位,必然也發(fā)揮著重要的作用。而在貝類中,僅見NCBI數(shù)據(jù)庫中上傳的ASS基因序列,具體的基因特征、功能研究等還未見有報道。

文蛤是我國重要的海產(chǎn)經(jīng)濟貝類之一,文蛤養(yǎng)殖尤其是以江蘇省為主產(chǎn)區(qū)的規(guī)模化養(yǎng)殖推動了貝類經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,同時,為響應國家綠色健康養(yǎng)殖的號召,江蘇沿海地區(qū)開展了文蛤與蝦蟹混養(yǎng)模式,取得良好的經(jīng)濟和生態(tài)效益。但由于近年來氣候原因引起的夏季溫度整體上升,文蛤在高溫季節(jié)死亡率明顯上升,給養(yǎng)殖戶帶來嚴重的經(jīng)濟損失。水溫是影響貝類攝食、生長、代謝和免疫反應的重要外界環(huán)境因素之一,更甚至會影響貝類的免疫系統(tǒng)和抗病能力,進而誘發(fā)貝類的高死亡率[18]。本研究篩選獲得了文蛤ASS基因的EST序列,使用RACE克隆技術獲得該基因的cDNA全長序列,使用生物信息學方法分析該基因的結構特征,以期為深入了解文蛤的免疫機制,也為后續(xù)項目組開發(fā)文蛤抗逆新品種奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 MmASS基因克隆

使用RACE技術(Rapid amplification of cDNA ends)克隆獲得MmASS基因cDNA全長。根據(jù)RNA提取試劑盒(天根)的說明書提取文蛤肝胰腺的總RNA,根據(jù)Clontech RACE試劑盒說明合成cDNA第一條鏈。在已知的MmASS基因EST序列上設計3’和5’RACE引物,F1:TTGGATCGGGAGGTGAGAAAAAT,R1:CAGCGCCTAGTTTCATAGCTTTC。PCR獲得目的基因產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用膠回收試劑盒(天根)進行純化回收,將純化產(chǎn)物與pMD18-T載體進行連接,使用E.coliCompetent Cells DH5α細胞開展目的基因的陽性克隆,篩選含有目的基因片段的菌液測序,并拼接獲得目的基因cDNA全長序列。引物合成和測序均由上海生工生物有限公司完成。

1.2 MmASS基因生物信息學分析

使用NCBI的ORF Finder尋找MmASS基因cDNA全長序列開放閱讀框,并使用blast驗證該基因與其他物種的相似性;運用DNAMAN 6.0 軟件進行序列拼接以及理化特性分析;使用ExPASy中的Compute pI/Mw工具計算分子量和理論等電點;使用SMART在線軟件分析蛋白質結構域;使用Swiss-Model工具預測MmASS蛋白質三維結構;使用ProtParam軟件分析該蛋白序列的親水和疏水性;使用TMHMM-2.0在線工具預測蛋白質的跨膜結構域;使用PSORT Prediction在線網(wǎng)頁進行亞細胞定位分析;運用MEGA 5.1 軟件,Neighbor-joining方法,采用 Bootstrap 法重復計算 1 000次,進行系統(tǒng)進化樹構建。

1.3 MmASS基因的表達特征分析

試驗所用文蛤為江蘇如東天然野生文蛤,運至實驗室后水泥池暫養(yǎng),水泥池內鋪設海沙,24 h連續(xù)充氣,定期換水,每日定期投喂金藻(Dicrateria)、扁球藻(Tetraselmis)等人工餌料,半個月后取樣。選取6個大小規(guī)格均一、殼色鮮亮、外表無破損的自然文蛤,低溫麻醉后分別取其鰓、外套膜、閉殼肌、足、肝胰腺等不同組織樣品,用1×PBS(磷酸鹽緩沖鹽水, 0.01 mol/L)洗滌后, 液氮速凍, -80 ℃冰箱凍存, 用于RNA提取。使用RNA提取試劑盒分別提取各個組織樣品的總RNA,使用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳及One Drop 2000超微量分光光度計檢測RNA的質量和濃度。RNA樣本檢測合格后,根據(jù)反轉錄試劑盒(天根)的操作說明合成cDNA,用于熒光定量分析實驗。

使用Bio-Rad CFX Connect熒光定量PCR儀分析MmASS基因的表達特征,設計并篩選熒光定量特異性引物,qPCR-F:GAGTATGCGAGGGTGAAAGGTAT,qPCR-R:GCATCTGTCTTAACTGTGCCATC。根據(jù)熒光定量試劑盒(Bio-Rad, USA)說明書配置體系:總體積25 μL, 其中cDNA 1 μL(100 ng), SsoFastTMEvaGreenSupermix (BioRad, USA)10 μL,特異性正向和反向引物各0.5 μL(10 μmol/L), ddH2O 13 μL。反應條件:95 ℃溫浴15 min, 活化Hot Start Taq DNA聚合酶, 然后按95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s進行40個循環(huán)。使用β-actin作為內參基因,β-F:TTGTCTGGTGGTTCAACTATG,β-R:TCCACATCTGCTGGAAGGTG。每個樣品做4個重復,每次PCR分析結束時進行擴增產(chǎn)物的解離曲線分析。根據(jù)2-ΔΔCt方法計算熒光定量數(shù)據(jù)[19],數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示,使用SPSS 20.0軟件對結果進行單因素方差(One-Way ANOVA)分析。

2 結果與分析

2.1 MmASS基因全長及結構域分析

使用RACE技術克隆文蛤ASS基因,使用DNAMAN軟件拼接獲得該基因全長序列,并將該基因命名為MmASS。結果顯示,該基因cDNA全長1 588 bp,其中1-59 bp為5’非翻譯區(qū)(Untranslated regions, UTR),60-1 307 bp為開放閱讀框(Open reading frame, ORF),共編碼415個氨基酸,1 308-1 588 bp為3’非翻譯區(qū),起始密碼為ATG,終止密碼為TGA,3’非翻譯區(qū)包含一個加尾信號AATAA和poly(A)尾巴。該基因分子量為46.81 kD,理論等電點pI為5.51。預測蛋白序列包含6個保守序列:(1)[A/S/L]-[F/Y]-S-G-G-[L/V]-D-T-[S/T](13-21 aa),(2)[F/Y/L]-[T/M/L]-A-[D/N]-[V/L/I]-G-Q(37-43 aa),(3)Y-x(3)-T-x(3)-R(90-98 aa),(4)G-x-T-x-[K/R/M]-G-N-D-x(2)-R-F(120-131 aa),(5)S-x-D-x-N-x(6)-E(183-194 aa),(6)E-[N/D]-R-x(4)-K-x(4)-Y-E(273-286 aa)。這些保守結構域主要集中了ATP結合位點、天門冬氨酸L-Asp結合位點以及瓜氨酸L-Cit結合位點(見圖1)。三維結構預測顯示該蛋白序列包含15個α螺旋和16個β折疊(見圖2)。ProtParam在線軟件分析結果顯示MmASS蛋白序列具有親水性(見圖3)。MmASS蛋白無跨膜結構域(見圖4)。

圖2 文蛤ASS蛋白三維結構預測Fig.2 Three dimensional structure prediction of MmASS

圖3 文蛤ASS蛋白的親疏水性分析Fig.3 Hydrophilic and hydrophobic properties of ASS in M.meretrix

圖4 文蛤ASS蛋白的跨膜結構域分析Fig.4 Analysis of transmembrane structure of ASS in M.meretrix

2.2 MmASS基因系統(tǒng)進化樹及氨基酸序列分析

使用MEGA5.1軟件構建系統(tǒng)進化樹,進化樹分析所用物種及登陸號見表1,結果如圖5所示。文蛤MmASS基因與縊蟶(Sinonovaculaconstricta)親緣關系最近,隨后與長牡蠣、貽貝、蝦夷扇貝等聚為一支。氨基酸序列相似性結果顯示,文蛤MmASS基因與縊蟶的ASS基因蛋白序列相似度最高,達78.31%;其次是長牡蠣(Crassostreagigas)72.36%和紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)71.33%。氨基酸序列對比圖(見圖6)中不同顏色表示氨基酸序列保守性的高低,深藍色表示序列的高保守性,由圖中可以看出,各物種的ASS基因的保守結構域相似度極高。

表1 系統(tǒng)進化樹中各物種ASS蛋白序列登錄號Table 1 Accession number of ASS proteins sequence in the phylogenetic tree

圖5 ASS系統(tǒng)進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of ASS proteins

圖6 文蛤ASS基因與其他物種的氨基酸序列對比圖Fig.6 Multi-sequence alignment of ASS in M. meretrix and other species

2.3 MmASS的亞細胞定位分析

表2為MmASS蛋白預測亞細胞定位的具體結果,預測MmASS在可能定位于細胞質、細胞核以及線粒體中,定位于細胞質中的可能性最高。

表2 文蛤ASS亞細胞定位預測Table 2 Predicted subcellular localization of ASS in M.meretrix

2.4 MmASS的組織表達特征

使用qPCR檢測MmASS基因在文蛤各個組織中的表達規(guī)律,結果如圖7所示。在被檢測的5個組織中(鰓、外套膜、閉殼肌、足、肝胰腺),MmASS均有表達,且在鰓中的表達量最高(P<0.05),其次是肝胰腺。

圖7 MmASS基因在不同組織中的表達Fig.7 Expression levels of MmASS in different tissues

3 討論

ASS是精氨酸代謝過程中的關鍵酶,同時也是尿素循環(huán)和NO合成的限速酶,一般分子量約46 kD,是由單肽構成的同源四聚體,ASS序列高度保守,主要包括核苷酸結合結構域、精氨酸琥珀酸合成結構域以及C端多聚化螺旋功能區(qū)域[3, 20]。本文運用3’和5’RACE技術首次克隆獲得文蛤MmASS基因的全長,共包含415個氨基酸殘基,分子量為46.81 kD。MmASS的預測氨基酸序列包含上述三大功能結構域,并存在6個高度保守片段,富集了ATP結合位點、天門冬氨酸L-Asp結合位點以及L-Cit結合位點。氨基酸序列比對結果顯示,MmASS的功能結構域與其他物種相似度極高,說明文蛤的ASS基因較為保守,且可能與其他物種的ASS一樣具有相似的基因功能。進化樹分析結果表明,MmASS基因與雙殼類親緣關系較近,聚為一大支,符合進化規(guī)律。貝類中還未見有ASS基因的詳細報道,本文首次開展了文蛤MmASS基因的克隆及特征分析,可為后續(xù)貝類的相關研究提供借鑒。

早期的研究認為ASS是一種胞質酶[21-22]。Cohen等[23]開展的亞細胞分離研究表明,該酶的一部分與線粒體的外膜相連。哺乳動物的ASS因組織細胞的不同或發(fā)育階段的不同而具有不同的亞細胞定位。在人體內皮細胞中,ASS定位于小泡和高爾基體外[24-25];牛的腸上皮細胞、腎小管細胞中,ASS分布于細胞質中,在動脈內皮細胞中,ASS分布在質膜周圍[26-27];大鼠胎兒時期,90%的ASS定位于的肝細胞中的線粒體,到大鼠成年時期,只有30%的ASS定位在的肝細胞線粒體中[28]。在大腸桿菌中,ASS定位在細胞質中[29]。本研究中亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn),MmASS蛋白位于細胞質的可能性最大。

ASS是一種普遍存在的酶,許多研究確定其活性存在于許多組織中。成年大鼠中,ASS的mRNA在各個組織中均有表達,如肝臟、腎臟、巨噬細胞、平滑肌細胞、眼細胞以及膠質細胞等,其表達量和蛋白酶活性在肝臟和腎臟中最高,而在腸中的表達量最低[20-21,30-31];此外,在人的胰島細胞、淋巴細胞,牛的肝臟、主動脈內皮細胞等均檢測到ASS的存在。Chng等[12]研究發(fā)現(xiàn),ASS基因在非洲肺魚的肝臟、腎臟、腦以及骨骼肌中均有表達。本研究的結果顯示,MmASS基因在文蛤的各個組織中均有表達,這與上述的研究結果相似。ASS的功能與其所在的組織,細胞的類型相關,不同的調控機制決定了ASS的不同生理功能。MmASS在文蛤的鰓中表達量最高,其次是肝胰腺。在雙殼貝類中,鰓和肝胰腺是重要的免疫組織,對調節(jié)貝類自身的免疫機制至關重要,可合成免疫因子啟動免疫反應以抵抗外來有害物質的入侵[32-33]。據(jù)此推測,MmASS參與調節(jié)文蛤各個組織的生理活動,可能在文蛤的免疫防御機制中發(fā)揮重要功能。本研究對文蛤ASS基因開展生物信息學分析,具體的功能還有待深入研究,可結合細胞亞細胞定位等技術深入開展基因功能的挖掘,以期為文蛤抗逆新品系的選育奠定理論基礎。

4 結 論

首次克隆獲得文蛤MmASS基因cDNA序列,該基因共編碼415個氨基酸,預測蛋白序列包含的6個保守功能域與其他物種具有較高的相似度,說明該基因高度保守。文蛤MmASS與縊蟶、貽貝、牡蠣等雙殼貝類的親緣關系最近。MmASS在文蛤鰓組織中的表達量最高,該基因可能在文蛤的免疫防御機制中發(fā)揮重要功能。本研究旨在為深入了解文蛤的免疫機制提供理論基礎。