miR-449a在乳腺癌組織中的表達及生物信息學分析

林 慧,陳佳菁,王燦明,鄭素瓊,邱建龍

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九一醫院 病理科,福建 泉州 362000)

乳腺癌是當前全球范圍內最常見的惡性腫瘤,發病率仍呈上升趨勢。作為一種高度異質性的疾病,基于組織病理、基因表達或基因組-轉錄組數據有多種分類方法,臨床工作中常根據雌激素受體(Estrogen receptor,ER)、孕激素受體(Progesterone receptor,PR)和人表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的表達將其分為管腔型、HER2過表達型和三陰性乳腺癌[1]。不同分子亞型的乳腺癌具有獨特的臨床表現、組織病理學特征、治療反應以及預后,深入了解其內在機制的差異對改進分類方法和發現潛在治療靶點至關重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內源性非編碼RNA,主要通過抑制翻譯或降解靶mRNA調控基因表達,在癌癥發病機制中發揮致癌或抑癌作用[2]。部分miRNA在乳腺癌中的表達存在異質性,與特定的分子亞型相關聯,可用于腫瘤的風險判斷和精準分類[3]。研究顯示miR-449a在乳腺癌、宮頸癌、肺癌、鼻竇腺癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤中異常表達,參與調控腫瘤增殖、遷移、侵襲等過程,但對其在不同亞型乳腺癌的作用了解有限[4-6]。本研究通過檢測miR-449a在乳腺癌組織中的表達,分析其與臨床病理特征的關系,并采用生物信息學方法探索其在腫瘤發生發展過程中可能的作用機制,以期為乳腺癌的研究提供一定的參考依據。

1 資料與方法

1.1 組織標本和臨床資料

選取本院2017年至2021年行手術切除的83例乳腺癌患者作為研究對象。納入標準:①首診患者,經病理組織學確診;②臨床病理資料完整,明確ER、PR和HER2蛋白的表達狀態;③病灶無明顯出血壞死區。排除標準:①術前接受過新輔助治療;②合并其他器官惡性腫瘤。本研究經醫院倫理委員會批準,患者或家屬簽署知情同意書。患者發病年齡27～81歲,平均年齡(50.48±12.11)歲,組織學類型包括浸潤性導管癌70例、伴髓樣特征的浸潤性癌9例、化生性癌4例;分子亞型包括管腔型43例、HER2過表達型19例、三陰性乳腺癌21例。選擇腫瘤石蠟包埋組織為觀察組,距腫物邊緣>2 cm的正常乳腺組織作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR檢測miR-449a表達水平

將石蠟標本以15 μm厚度切片,按石蠟組織切片miRNA提取試劑盒(北京天根生化科技公司)說明書提取RNA。按逆轉錄試劑盒(美國APExBIO公司)操作步驟將RNA逆轉錄為cDNA。miR-449a逆轉錄引物序列:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCAGC。將合成的cDNA 稀釋為統一濃度后,按照熒光定量PCR試劑盒說明書(南京諾唯贊生物科技公司)進行操作,配制20 μL反應體系:cDNA模板2 μL、引物0.8 μL、SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、ddH2O 7.2 μL。miR-449a上游引物:CGCGTGGCAGTGTATTGTTA,下游引物:AGTGCAGGGTCCGAGGTATT。反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸15 s,循環45次。記錄Ct值,以U6為內參照,采用2-ΔΔCt法計算miR-449a的相對表達量。

1.2.2 生存數據分析

使用Kaplan-Meier Plotter數據庫(https://kmplot.com/analysis/)進行在線分析,選擇METABRIC數據集和默認參數,比較miR-449a表達與不同亞型乳腺癌患者總生存率的關系。

1.2.3 靶基因預測和富集分析

從ENCORI網站(https://starbase.sysu.edu.cn/index.php)下載miRNA-mRNA相互作用數據,選擇TargetScan、miRanda和PicTar三個數據庫共同的預測結果作為預測靶基因集合。應用metascape在線數據庫(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)對所預測的靶基因集合進行基因本體(Gene ontology,GO)分析、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析。

1.2.4 編碼蛋白互作網絡分析

使用string數據庫(https://cn.string-db.org/)進行編碼蛋白相互作用(Protein-protein interaction,PPI)網絡分析。將數據結果導入Cytoscape 3.9.1軟件,使用MCODE插件進行PPI子網絡的聚類模塊分析。

1.2.5 miR-449a與靶基因表達的相關性分析

使用ENCORI數據庫探索乳腺癌組織miR-449a與靶基因表達的相關性,mRNA和miRNA數據來源于癌癥基因組圖譜(The cancer genome atlas,TCGA),并經log2(FPKM/RPM + 0.01)轉換。

1.3 統計學處理

運用SPSS 26.0軟件對數據進行統計處理,計量資料以均數±標準差表示,組間差異比較采用配對t檢驗,多組資料兩兩比較采用Games-Howell法,計數資料以例和百分率表示,行χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果分析

2.1 乳腺癌和癌旁正常組織miR-449a表達水平比較

乳腺癌組織中miR-449a表達水平(1.33±0.67)高于癌旁正常組織(1.02±0.41),差異具有統計學意義(t=3.801,P<0.001,見圖1a)。進一步比較每例樣本癌旁組織和癌組織的表達,結果顯示,與癌旁組織相比,miR-449a在38.6%(32/83)的乳腺癌組織中表達下調(見圖1b),其中包括13例管腔型乳腺癌、6例HER2過表達型乳腺癌和13例三陰性乳腺癌,說明miR-449a在乳腺癌組織中的表達存在明顯的異質性。

圖1 miR-449a在乳腺癌和癌旁組織中的表達水平Fig.1 Expression level of miR-449a in breast cancer tissues and adjacent tissues

2.2 不同分子亞型乳腺癌miR-449a表達水平比較

進一步比較不同分子亞型乳腺癌miR-449a的表達,結果顯示其在三陰性乳腺癌中表達水平最低(0.90±0.39),在管腔型乳腺癌中的表達水平最高(1.56±0.71),兩組之間的差異具有統計學意義(P<0.001),而HER2過表達型乳腺癌(1.29±0.63)與其他亞型之間的差異不具有統計學意義(P>0.05,見圖2)。

圖2 miR-449a在不同分子亞型乳腺癌中的表達水平Fig. 2 Expression level of miR-449a in different molecular subtypes of breast cancer

2.3 miR-449a表達水平與患者臨床病理特征的關系

根據乳腺癌組織miR-449a表達水平的平均值,將患者分為低表達組43例,高表達組40例。分析miR-449a表達水平與乳腺癌患者臨床病理特征的關系,結果顯示其與腫瘤組織學級別、腫瘤大小以及ER、PR的表達狀態有關(P<0.05),與患者年齡、腫瘤發生部位、淋巴結轉移、TNM分期以及HER2表達狀態無相關性(P>0.05,見表1)。

表1 miR-449a表達水平與乳腺癌患者臨床病理特征的關系 n(%)Table 1 Relationship between the expression level of miR-449a and the clinicopathological features of patients with breast cancer n(%)

2.4 miR-449a表達水平與不同分子亞型乳腺癌患者預后的關系

使用Kaplan-Meier plotter數據庫分析miR-449a表達水平與不同亞型乳腺癌患者總生存率的關系,結果顯示,在管腔B型乳腺癌中miR-449a高表達組總生存率顯著低于低表達組(P<0.01),在三陰性乳腺癌中miR-449a低表達組總生存率顯著低于高表達組(P<0.05,見圖3),相反的趨勢提示miR-449a在不同分子亞型乳腺癌的作用可能存在差別。此外,管腔A型、HER2過表達型乳腺癌患者的總生存率與miR-449a的表達水平無關(P>0.05)。

圖3 miR-449a表達水平與不同分子亞型乳腺癌患者預后的關系Fig. 3 Relationship between miR-449a expression level and prognosis of patients with different molecular subtypes of breast cancer

2.5 miR-449a靶基因預測和富集分析結果

預測結果篩選出186個miR-449a靶基因,GO分析提示蛋白功能主要涉及細胞成分形態發生、間充質細胞分化、器官發育、組蛋白修飾、細胞遷移的正向調控、囊泡介導的轉運調控等生物學過程(見圖4)。KEGG分析結果顯示miR-449a靶基因富集于內分泌抵抗、粘附連接、粘著斑、肌動蛋白細胞骨架調節以及NOTCH、TGF-β、Wnt、Ras、MAPK、PI3K-Akt等介導的信號通路,其中多個靶基因已知與乳腺癌關系密切(見表2)。

表2 miR-449a預測靶基因KEGG通路分析結果Table 2 Result of KEGG pathway anaysis of predicted miR-449a target genes

圖4 miR-449a預測靶基因GO分析結果Fig.4 Result of GO analysis of predicted miR-449a target genes

2.6 編碼蛋白互作網絡分析

將靶基因集合上傳至string數據庫構建PPI網絡,該網絡包含137個節點和276條邊,平均局部聚類系數為0.357,數據導入Cytoscape進行可視化(見圖5a)。使用MCODE插件進行分析,篩選出以Notch受體1(Notch receptor 1,NOTCH1)、Notch配體1(Jagged canonical Notch ligand 1,JAG1)、細胞周期蛋白D1(cyclin D1,CCND1)等為核心的子網絡(見圖5b)。

圖5 蛋白質互作網絡分析結果Fig. 5 Result of analysis of protein-protein interaction network

2.7 miR-449a與靶基因表達的相關性分析

進一步分析miR-449a與NOTCH信號通路靶基因(見表2)表達的相關性,結果顯示miR-449a與NOTCH1在乳腺癌組織中的表達呈負相關(r=-0.186,P<0.001,見圖6)。

圖6 miR-449a與NOTCH1在乳腺癌組織中表達的相關性Fig. 6 Correlation of miR-449a expression with NOTCH1 in breast cancer tissues

3 討 論

miR-449家族包括miR-449a、miR-449b、miR-449c,由位于染色體5q11.2的基因簇所編碼,這一區域已被鑒定是癌癥易感區域[7]。miR-449a在人類肺、氣管和睪丸中高表達,在非小細胞肺癌、肝細胞癌、鼻竇腺癌等多種惡性腫瘤中常常下調表達,發揮抑癌作用[6-8]。目前miR-449a與乳腺癌相關的研究結論存在一些矛盾。有報道顯示miR-449a在乳腺癌組織和細胞系表達下調,過表達miR-449a對乳腺癌細胞起抑制作用[9]。但也有研究發現miR-449a在淋巴結未轉移的浸潤性導管癌中高表達,其表達與患者復發率增加和總生存期、無病生存期降低顯著相關,在體外可促進多種乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲[10]。本研究結果顯示miR-449a在乳腺癌組織中的表達呈現出高度的異質性,雖然總體水平高于癌旁組織,但其中有38.6%的病例出現表達下調,因此不同研究結論的矛盾在一定程度上與納入的樣本有關。

本組資料顯示miR-449a的表達與腫瘤組織學級別和大小有關,在高級別、體積大的乳腺癌中表達降低,提示其在乳腺癌進展中一定程度上發揮抑癌作用。乳腺癌是具有不同生物學和表型特征的異質性疾病,miR-449a的表達水平在不同分子亞型乳腺癌間存在差異,尤其是三陰性乳腺癌表達水平顯著低于管腔型。三陰性乳腺癌是一種高侵襲性亞型,具有很強的增殖能力和高轉移風險,上皮間充質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關的形態學和功能改變是其獲得侵襲性的關鍵事件。靶基因及富集分析結果顯示miR-449a的功能涉及間充質細胞分化、細胞遷移、粘附連接、粘著斑、肌動蛋白細胞骨架調節等生物學過程,提示miR-449a的功能與腫瘤獲得侵襲性密切相關。體外實驗表明在三陰性乳腺癌細胞系中上調miR-449a的表達后可抑制細胞遷移和EMT進程并促進細胞凋亡,從而發揮抗腫瘤作用[2]。生存分析結果顯示miR-449a低表達的三陰性乳腺癌患者總生存率顯著低于高表達者。

miR-449a在管腔型乳腺癌中高表達,表達水平與激素受體ER、PR陽性狀態有關。先前有研究發現miR-449a在ER陽性的乳腺癌細胞株MCF-7中的表達顯著高于正常乳腺上皮細胞,敲低后則會抑制癌細胞增殖和遷移[11]。管腔B型是ER陽性乳腺癌中侵襲性較強的類型,生存分析結果顯示miR-449a在該亞型中表達較高的患者預后更差,提示miR-449a在該亞型腫瘤進展過程中可能發揮重要作用,但具體機制目前尚未闡明。有研究發現miR-449a表達增加與磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α(Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha,PIK3CA)突變狀態有關,后者是ER陽性乳腺癌中最常見的體細胞突變癌基因[12]。PIK3CA突變導致PI3K-Akt信號通路的異常激活,可促進乳腺癌細胞的生長和侵襲[13]。靶基因預測結果也顯示miR-449a調控PI3K-Akt信號通路的多個基因,因此miR-449a在乳腺癌中發揮抑癌或致癌作用,可能取決于不同亞型或發展階段。

KEGG富集分析結果顯示miR-449a參與NOTCH、TGF-β、Wnt、PI3K-Akt等多種信號通路,通過PPI網絡分析篩選關鍵子網絡,主要由NOTCH1、JAG1和cyclin D1等蛋白所構成。NOTCH信號通路是一種細胞間通信系統,可廣泛調控細胞生物學特性,如干細胞維持、上皮細胞極性/粘附、細胞增殖和凋亡等,在器官發育和維持組織穩態中發揮重要作用[14]。異常激活的NOTCH信號與多種惡性腫瘤的遷移、侵襲和轉移密切相關,NOTCH1作為NOTCH受體家族成員之一,在信號轉導中起關鍵作用[15]。本研究基于TCGA數據發現miR-449a在乳腺癌組織中的表達與NOTCH1呈負相關。NOTCH1在三陰性乳腺癌中的表達最為顯著,可能通過誘導多種EMT相關基因的表達,促進管腔細胞向基底型分化,從而參與三陰性乳腺癌的發生發展過程[16]。JAG1是NOTCH信號通路的重要配體,在乳腺癌中的表達水平與腫瘤侵襲進展、轉移及不良預后有關[17]。JAG1表達陽性率在不同亞型的乳腺癌中同樣也存在差異,在三陰性乳腺癌中表達率最高且與ER、PR的表達呈負相關[18]。Poddar等[19]已證實miR-449a可靶向作用于JAG1從而在骨骼肌細胞中調控NOTCH信號。cyclin D1在細胞周期控制中起核心作用,是NOTCH1的直接靶點,在三陰性乳腺癌中JAG1可介導NOTCH1對cyclin D1啟動子的轉錄激活,從而促進腫瘤細胞增殖[20]。而在ER陽性的乳腺癌中,cyclin D1則是雌激素調控細胞周期進程的重要組成,并可直接結合ER的激素結合域,在雌激素缺乏的情況下也能介導基因轉錄,過表達與腫瘤的高增殖和不良預后相關[21-22]。

4 結 論

miR-449a的表達水平在三陰性和管腔型乳腺癌中存在顯著差異,可通過影響多種信號通路參與腫瘤發展過程,調控NOTCH信號通路可能是其在乳腺癌中的重要機制。鑒于調控網絡復雜,miR-449a在乳腺癌分型和靶向治療方面的潛在價值仍有待深入研究。