基于乳酸相關基因腸癌預后模型的建立與分析

鐘世順 梁瑋 許炎欽 劉進生

腸癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在男性和女性中均居前五位[1]。隨著治療技術的發(fā)展，腸癌患者5 年生存率在過去20 年中逐漸提高[2]，但死亡率仍然較高。因此，挖掘腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的生物標志物具有重要意義。

乳酸是糖無氧酵解代謝的終產(chǎn)物，以前被認為是癌癥進展中的無用代謝物。最近的研究表明，乳酸是癌癥發(fā)展、維持腫瘤微環(huán)境和轉移的重要調(diào)節(jié)劑[3]。在乳腺癌中，乳酸相關基因GPR81 表達上調(diào)并通過從腫瘤細胞中釋放乳酸來促進腫瘤生長[4]；有研究表明，乳酸脫氫酶A 是腎透明細胞癌的預后標志物[5]。乳酸/BDNF/TrkB 信號可介導上皮-間質相互作用并導致胃癌細胞對安羅替尼產(chǎn)生耐藥性[6]。有研究表明，乳酸與腫瘤免疫微環(huán)境相關，乳酸水平升高是腫瘤微環(huán)境酸中毒的主要原因，其抑制CD8+和CD4+效應T 細胞功能，并有利于免疫抑制性Treg 細胞的發(fā)育[7]。

乳酸在癌癥進展、預后和免疫微環(huán)境中具有重要價值。然而，乳酸相關基因在腸癌中尚未得到很好的研究。本研究開發(fā)并驗證了一種乳酸相關基因預后模型來預測腸癌患者的預后及免疫浸潤，可能為腸癌患者預后評估提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集本研究利用TCGA 及GEO 數(shù)據(jù)庫獲得腸癌患者癌組織及癌旁組織的基因表達數(shù)據(jù)，TCGA 腸癌數(shù)據(jù)集包含456 例腸癌患者癌組織及41 例癌旁組織，GSE39582 數(shù)據(jù)集包含585 例腸癌患者組織及臨床數(shù)據(jù)。通過“乳酸”作為搜索關鍵詞查詢Molecular Signatures Database（MSigDB）數(shù)據(jù)庫，獲得了284 個乳酸相關基因。

1.2 鑒定腸癌中差異表達的乳酸相關基因利用“ limma”R 包分析TCGA 數(shù)據(jù)集中腸癌組織和癌旁組織的差異表達中乳酸相關基因。將|log2FC|≥0.585 且FDR<0.05 的基因定義為差異表達基因。

1.3 腸癌乳酸相關基因預后模型的構建和驗證利用單變量Cox 回歸分析確定了具有預后價值的乳酸相關基因，然后使用“glmnet”R 包對單變量Cox回歸分析獲得的具有預后價值的基因進行LASSO回歸分析。在LASSO 分析中，先通過10 倍交叉驗證檢測獲得最佳調(diào)諧參數(shù)lambda（λ），根據(jù)最佳λ 值獲得具有系數(shù)的預后基因列表。乳酸相關基因預后模型Risk Score 的得分為每個基因的系數(shù)×相應基因的表達值的總和。Kaplan-Meier 生存分析對不同風險組進行預后評估。此外，按照年齡、性別及stage 對腸癌患者進行亞組分層，評估預后模型在不同亞組中的臨床價值。

1.4 評估兩個Risk score 組的免疫浸潤基于TCGA 腸癌數(shù)據(jù)，并通過CIBERSORT 算法評估每個腸癌組織中腫瘤浸潤免疫細胞的比例，分析不同風險組的免疫浸潤差異。

1.5 統(tǒng)計學分析采用Student't檢驗計算差異性表達。通過Kaplan-Meier 方法計算總生存率，并通過log-rank test 檢驗分析各組之間的差異。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 鑒定腸癌患者組織中差異表達的乳酸相關基因基于TCGA 數(shù)據(jù)集，我們分析了284 個乳酸相關基因在腸癌患者組織及癌旁組織中的差異表達。結果顯示與癌旁組織相比，腸癌組織中有36 個基因表達顯著上調(diào)，42 個基因表達顯著下調(diào)（見圖1），其中表達上調(diào)倍數(shù)最高的前5 個基因分別是HS6ST2、CA5A、PUS1、TWNK 和PNPT1；下調(diào)倍數(shù)最高的前5 個基因分別是COX6A2、PCK1、LDHD、LDHAL6B 和SLC3A1。

圖1 基于TCGA 數(shù)據(jù)分析腸癌患者組織中差異表達的乳酸相關基因

2.2 乳酸相關基因預后模型的開發(fā)與評估通過單變量Cox 回歸分析78 個差異表達基因對腸癌患者預后的影響。結果顯示TPK1 及MPC1 是腸癌患者的預后影響因素（見圖2A）。利用LASSO 回歸分析建立乳酸相關基因預后模型。結果顯示當LASSO 模型中的調(diào)諧參數(shù)（λ）=0.0017 時，模型可以達到最佳擬合（見圖2B）。此時，TPK1 和MPC1基因的LASSO 系數(shù)分別是-0.307 和-0.309（見圖2C）。因此，乳酸相關基因預后模型Risk Score=（-0.307×TPK1 表達量）+（-0.309×MPC1 表達量）。隨后，我們評估了乳酸相關基因預后評估模型在腸癌患者預后預測中的能力。Kaplan-Meier 生存分析結果表明Risk Score 高（高風險組）的患者生存期顯著短于Risk Score 低（低風險組）的腸癌患者（見圖2D）。圖2E 展示了Risk Score 相關基因、Risk Score 及腸癌患者預后之間的相關性。從圖中可看出TPK1 和MPC1 基因的表達越低，則Risk Score越高；Risk score 越高，則腸癌患者預后越差。

圖2 乳酸相關基因預后模型的構建

為了評估乳酸相關基因預后模型的穩(wěn)定性，我們將腸癌患者進行分層及Kaplan-Meier 生存分析，以進一步探討該預后模型是否適用于不同的臨床亞組。在女性腸癌患者（見圖3A）及男性腸癌患者（見圖3B）的亞組中，高風險組的患者整體生存顯著差于低風險組。在患者年齡≤60 歲（見圖3C）、患者年齡>60 歲（見圖3D）、患者Stage=1&2（見圖3E）及患者Stage=3&4（見圖3F）的亞組中，高風險組腸癌患者整體生存也是顯著低于低風險組。

圖3 預后模型的不同臨床亞組驗證

2.3 乳酸相關基因預后模型的驗證為了進一步評估該預后模型的有效性，我們使用了GSE39582腸癌數(shù)據(jù)集作為驗證集。生存分析結果顯示，在GSE39582 數(shù)據(jù)集中，高風險組的腸癌患者整體生存顯著差于低風險組（見圖4）。

圖4 預后模型的驗證

2.4 乳酸相關基因預后模型與免疫浸潤為了進一步研究兩個風險組間的免疫浸潤差異，利用CIBERSORT 分析兩組之間的免疫細胞浸潤情況。結果表明在低風險組中，T cells CD4 memory resting免疫細胞的浸潤情況顯著低于高風險組（見圖5）。

圖5 高風險組及低風險組的免疫浸潤分析

2.5 Nomogram 的構建和評估為了使我們的模型更好地輔助臨床決策，我們構建了一個列線圖來預測1 年、3 年和5 年的生存率（見圖6A），校準曲線證明我們的預后列線圖可以準確預測生存率（見圖6B）。

圖6 Nomogram 的構建與評估

3 討論

腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其特征在于腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境的腫瘤異質性會使腸癌的治療復雜化[8，9]。最近的研究揭示了乳酸在腫瘤免疫微環(huán)境中的不同作用。盡管癌細胞有足夠的氧氣供應，但仍然會消耗葡萄糖并過度產(chǎn)生乳酸，這可能會導致酸中毒、血管生成和免疫抑制[10]。在多種腫瘤中，乳酸對于預測預后和腫瘤微環(huán)境至關重要[11]。然而，乳酸在腸癌中的預后價值在很大程度上仍然未知。本研究分析了乳酸相關基因在腸癌的預后預測及免疫微環(huán)境中的作用。

本研究先確定了78 個差異表達的乳酸相關基因，接著利用Cox 回歸分析、LASSO 分析構建腸癌乳酸相關基因預后模型，該模型包含TPK1 和MPC1 兩個基因。研究表明，TPK1 可以促進腫瘤的進展[12]。TPK1 在腸癌中的作用還未得到充分研究，目前的研究主要集中在肝癌、胰腺癌和宮頸癌等其他類型的腫瘤上。研究顯示，TPK1 可以促進腫瘤細胞的代謝和增殖，增強其對營養(yǎng)物質的利用，從而促進腫瘤生長和轉移[13～15]。但是，TPK1 在腸癌發(fā)生、發(fā)展、治療等方面的具體作用還需進一步研究。MPC1 是一種介導細胞質和線粒體內(nèi)丙酮酸轉運的蛋白質[16，17]。一些研究表明，MPC1 可以調(diào)節(jié)腸癌細胞的代謝和增殖，從而影響腸癌的發(fā)生和發(fā)展。具體來說，MPC1 在腸癌細胞中的表達水平通常會升高，高表達的MPC1 會增加腸癌細胞對外源性丙酮酸的攝取和利用，從而增加腸癌細胞的代謝和增殖能力[18]。此外，MPC1 在腸癌細胞的生存和細胞內(nèi)ATP 生成中也發(fā)揮著重要作用。

進一步的生存分析驗證了腸癌乳酸相關基因預后模型的可靠性。臨床亞組分層分析結果表明，該預后模型適用于不同的腸癌臨床亞組?？紤]到免疫細胞在腫瘤免疫浸潤中的重要性，我們進一步評估了每個結腸癌標本中免疫細胞的相對比例。有證據(jù)表明，腫瘤和微環(huán)境之間的相互作用在結腸癌的進展和對免疫療法的反應率中起至關重要的作用[19，20]。本研究發(fā)現(xiàn)低風險組中，T cells CD4 memory resting 免疫細胞的浸潤情況顯著低于高風險組。有研究發(fā)現(xiàn)T cells CD4 memory resting 浸潤程度高與腸癌預后較差相關[8]。因此，乳酸相關基因預后模型評估腸癌的預后價值可能與T cells CD4 memory resting 免疫細胞浸潤程度相關。此外，Nomogram 的構建為臨床醫(yī)生做出決策提供參考。

本研究結果表明乳酸相關基因與腸癌患者預后密切相關，說明乳酸可能與腸癌具有一定的關聯(lián)，但是同樣值得注意的是，除了人體器官會產(chǎn)生乳酸，雙歧桿菌等微生物也會產(chǎn)生乳酸。雙歧桿菌可以發(fā)酵腸道中的不可消化的多糖等物質，產(chǎn)生乳酸和其他短鏈脂肪酸，為腸道細胞提供能量和營養(yǎng)物質，同時還可以降低腸道內(nèi)的pH 值，影響病原微生物的生長[22]。相比于其他器官，腸道內(nèi)乳酸的來源相對復雜，有待進一步深入挖掘乳酸在腸癌中的作用。

本研究存在一些局限性：首先，需要更多的臨床樣本來驗證該預后模型；其次，需要進一步研究乳酸與腸癌免疫浸潤的相關性。

綜上，本研究探討了乳酸相關基因與腸癌之間的關聯(lián)，通過建立乳酸相關基因預后模型以預測腸癌患者的存活率，可能為腸癌臨床診治提供一定的幫助。