東北傳統(tǒng)甜酸茶中乳酸菌分離鑒定及益生特性研究

徐世航，鄭 妍，岳松燁，朱瓊瑤，趙 宇，邊 鑫

（哈爾濱商業(yè)大學，黑龍江哈爾濱 150028）

甜酸茶是發(fā)源于中國北方的一種以小米和大豆等谷物為原料經(jīng)自然發(fā)酵制成的飲品。甜酸茶的主要功能菌種是乳酸菌，大部分乳酸菌在人體內(nèi)能發(fā)揮益生作用，促進人體健康[1-2]。因此，從甜酸茶中分離篩選乳酸菌，將有助于益生菌資源的開發(fā)。本文采用傳統(tǒng)分離法從甜酸茶中得到乳酸菌，并對其進行分子生物學鑒定和生理生化鑒定，同時評價乳酸菌的安全性及胃腸道耐受能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜酸茶（市售）；MRS 液體培養(yǎng)基、瓊脂、M17培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒，黑龍江久豐生物公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛膽鹽，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；無水乙醇、PBS 緩沖液等其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動高壓滅菌鍋，上海力申科學儀器有限公司；DL201 型恒溫自動干燥箱，天津市實驗儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 甜酸茶中的乳酸菌分離

將甜茶和酸茶樣品用0.9%的生理鹽水稀釋10倍，將各自的溶液涂在固體MRS 平板上，在37 ℃下培養(yǎng)48 h。從平板上選擇不同形態(tài)和大小的單個菌落，將其刮除并清洗數(shù)次，選擇符合優(yōu)勢菌形態(tài)特征的菌落進行液體培養(yǎng)，并將其置于-80 ℃的甘油冷凍管中保存，以便進一步研究。

1.3.2 乳酸菌的形態(tài)

采用革蘭氏染色試劑盒將分離后待檢測的菌株置于載玻片上進行染色，在顯微鏡下觀察菌株形態(tài)，根據(jù)形態(tài)判斷菌株為革蘭氏陽性菌（G+）或革蘭氏陰性菌（G-）。

1.3.3 生理生化鑒定

將乳酸菌的菌液接種到不同培養(yǎng)基上，在無菌條件下進行培養(yǎng)，采用生理生化試劑盒對乳酸菌進行產(chǎn)過氧化氫酶、產(chǎn)硫化氫、葡萄糖產(chǎn)氣、葡萄糖產(chǎn)酸、淀粉水解和糖發(fā)酵能力等生理生化鑒定，根據(jù)鑒定結(jié)果初步確定菌株種屬。

1.3.4 分子學鑒定

利用16S rDNA 基因序列研究方法對純化后的菌株進行分子學鑒定，將16S rDNA 測序并拼接所得的序列導(dǎo)入NCBI，進行BALS 比對，所得結(jié)果導(dǎo)出后，應(yīng)用MEGA 5.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹進行分析。

總而言之，數(shù)學思想屬于一項系統(tǒng)性的工程，可能會受到多種因素的影響。小學數(shù)學教師要做好課前準備、課中帶領(lǐng)學生自主探究、課后鞏固內(nèi)化工作，隨時對教學規(guī)律進行探索，在日常教學過程中滲透數(shù)學思想，提高學生的數(shù)學成效。

1.3.5 優(yōu)勢菌安全性評價

（1）抗生素抗性試驗。將篩選獲得的兩株乳酸菌菌株接種在3%的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h，將0.1 mL 細菌溶液均勻地涂布在裝有MRS 培養(yǎng)基的瓊脂平板上。將含有標準劑量抗生素的3 塊紙片放在MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h。監(jiān)測抑制周期的出現(xiàn)，根據(jù)美國國家臨床實驗室標準委員會（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）的標準，用抑制周期的直徑確定細菌是否對抗生素有抗性。該檢測中使用的抗生素是氨芐西林、頭孢噻吩、環(huán)丙沙星、氯霉素、頭孢曲松、頭孢噻肟、紅霉素、慶大霉素、林可霉素、青霉素、利福平、復(fù)方新諾明和四環(huán)素[3]。

（2）溶血試驗。分別對篩選獲得的兩株乳酸菌菌株取樣，以3%的濃度在MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后在血瓊脂培養(yǎng)基上打3 個孔并向每個孔中加入100 μL 菌液，在37 ℃下培養(yǎng)48 h，查看有無溶血圈，從而判斷對人體健康的影響程度。

1.3.6 模擬胃腸道消化試驗

乳桿菌對人工模擬胃液的耐受性參照程爽等[4]和MARAGKOUDAKIS 等[5]的方法進行評價。取1 mL 乳桿菌菌液，在10 000×g、4 ℃條件下離心5 min 后，棄上清收集菌體，用PBS 緩沖液（pH=7）洗滌兩次，瀝干后備用。調(diào)節(jié)HCl 溶液的pH 值為2.5，分別加入濃度為0.3 mg·mL-1的胃蛋白酶，配制成模擬胃液。調(diào)節(jié)PBS 緩沖液的pH 值為6.8，加入濃度為0.1 mg·mL-1的胰蛋白酶，配制成模擬腸液。將PBS 緩沖液調(diào)節(jié)成pH 值為8.0 的溶液，加入膽鹽配制成濃度為0.3%的膽鹽溶液。取1 mL 模擬胃液、1 mL 模擬腸液和1 mL 膽鹽溶液分別加入盛有菌體的離心管中，充分混勻后，37 ℃下培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1 h、2 h 和3 h 時取樣，涂布于MRS 瓊脂培養(yǎng)基進行平板計數(shù)，計算乳桿菌菌液濃度。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 2019 和SPSS 22 進行數(shù)據(jù)處理、分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的初篩鑒定結(jié)果

圖1 初篩菌株BIAN-tsc1 的形態(tài)學觀察及顯微觀察

圖2 初篩菌株BIAN-tsc2 的形態(tài)學觀察及顯微觀察

2.2 生理生化試驗結(jié)果

通過過氧化氫酶、硫化氫、葡萄糖產(chǎn)氣、葡萄糖產(chǎn)酸、淀粉水解和糖發(fā)酵試驗分析了菌株BIANtsc1 和BIAN-tsc2 的生理生化特性，結(jié)果見表1 和表2。由表1 可明顯看出兩菌株的過氧化酶試驗、硫化氫試驗和葡萄糖產(chǎn)氣試驗結(jié)果顯示均為陰性，而葡萄糖產(chǎn)酸試驗均為陽性，該結(jié)果與乳酸菌的生理生化鑒定結(jié)果相同。淀粉水解試驗結(jié)果顯示，BIANtsc1 為陽性，而BIAN-tsc2 為陰性，說明BIAN-tsc1可能有產(chǎn)淀粉酶能力。

表1 菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 的部分生理生化特性

表2 菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 的糖發(fā)酵特性

由表2 可明顯看出這兩種菌株在培養(yǎng)過程中都可以很好地利用果糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖和核糖，但只有菌株BIAN-tsc1可以利用阿拉伯糖和木糖，該對比符合乳酸菌的糖發(fā)特性，說明兩種菌株都能利用多種糖類作為碳源生長。

2.3 初篩菌株的分子生物學鑒定結(jié)果

對兩株菌株進行16S rDNA 測序后進行同源性比對，結(jié)果顯示，菌株BIAN-tsc1 在NBCI 數(shù)據(jù)庫中比對后的同源性為100%的前20 的菌種均為植物乳桿菌。選取序列同源性較高的菌株與菌株BIAN-tsc1進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，見圖3。菌株BIAN-tsc1 與植物乳桿菌菌株在同一個分支中，且它們之間的遺傳距離遠小于其他菌株，故確定菌株BIAN-tsc1 為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

圖3 菌株BIAN-tsc1 的系統(tǒng)發(fā)育樹

菌株BIAN-tsc1 在NBCI 數(shù)據(jù)庫中比對后的同源性為100%的前20 的菌種均為棒狀乳桿菌。選取序列同源性較高的菌株與菌株BIAN-tsc2 進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，見圖4。菌株BIAN-tsc2 與棒狀乳桿菌菌株在同一個分支中，且它們之間的遺傳距離遠小于其他菌株，故確定菌株BIAN-tsc2 為棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）。

圖4 BIAN-tsc2 的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 乳酸菌安全性評價

2.4.1 抗生素敏感性

菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 對所選抗生素的抗性試驗結(jié)果見表3。根據(jù)NCCLS 的標準對兩種菌進行判斷，兩種菌株對抗生素的抗性試驗表明它們對大多數(shù)抗生素不敏感，可知這兩種菌有較高的安全性。

表3 菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 的抗生素抗性

2.4.2 溶血性

如圖5 所示，將菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 置于37 ℃條件下培養(yǎng)48 h 后，觀察血瓊脂培養(yǎng)基上的3 個穿孔，發(fā)現(xiàn)每個穿孔附近一周均沒有出現(xiàn)溶血圈，說明兩個菌株均不具有溶血性。該安全評估試驗結(jié)果表明自然發(fā)酵的甜茶和酸茶樣品中菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 對人體健康無害，可用于食品發(fā)酵。

圖5 BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 的溶血作用情況

2.5 乳酸菌的益生特性

人體胃內(nèi)的pH 值為2.5 左右，食物在胃中的停留消化時間為2 ～4 h，乳酸菌進入消化道，往往由于胃液、腸液和膽鹽的極端環(huán)境導(dǎo)致活菌數(shù)大量下降，無法在體內(nèi)發(fā)揮益生作用。因此，本研究考察3 h內(nèi)BIAN-tsc1 菌和BIAN-tsc2 菌的存活情況，結(jié)果見表4。兩株菌在pH=2.5 的人工模擬胃液、pH=6.8 的腸液和0.3%的膽鹽溶液中培養(yǎng)3 h 后，其活菌數(shù)幾乎沒有變化，始終保持在7 logCFU·mL-1左右，說明菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 對胃液和腸液具有良好的耐受性，可在小腸下部或大腸中發(fā)揮其功能性。

表4 菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 對人工模擬胃液的耐受性

3 結(jié)論

從東北傳統(tǒng)甜酸茶中分離出兩株乳酸菌BIANtsc1 和BIAN-tsc2，經(jīng)生理生化及16S rDNA 鑒定確定兩株菌分別為植物乳桿菌和棒狀乳桿菌。BIANtsc1 和BIAN-tsc2 能利用大多數(shù)糖作為碳源進行生長增殖，其中，BIAN-tsc1 具有降解淀粉的能力。通過對抗生素和溶血性評價，確定BIAN-tsc1 和BIANtsc2 對大多數(shù)抗生素均不敏感，沒有溶血作用，且具有較好的胃腸道耐受能力。