青花椒提取物對金黃色葡萄球菌抑制作用研究

張文艷，李茂東，黃 堃，趙仲霞，阮蘇夢，師 睿*

（1.昭通學院 化學化工學院，云南昭通 657000；2.云南三鑫職業技術學院 醫藥健康學院，云南文山 663000）

花椒是藥食兩用的植物性原料，研究花椒的抑菌活性意義重大[1]。本研究從天然抑菌產物角度出發，研究青花椒提取物對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制作用，深化昭通農副產品的精深加工[2]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青花椒，昭通市永善縣；營養肉湯培養基、營養瓊脂，廣東環凱微生物科技有限公司；鉀離子檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；96 孔板，NEST；移液槍，大龍興創實驗儀器（北京）有限公司；PT-3502 C 全波長酶標分析，北京普天新橋技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 青花椒提取物的制備

粉碎后過60 目篩的青花椒與75%酒精按照料液比1 ∶15（m∶v）混合，浸泡過夜，50 ℃超聲提取50 min，濾液濃縮至浸膏，配制成母液，過濾除菌，-80 ℃保存備用。

1.2.2 濾紙片的準備

用6 mm 打孔器對濾紙打孔，121 ℃滅菌15 min，烘干備用，滅菌后的濾紙不能久放，否則會影響實驗結果的可靠性[3]。

1.2.3 菌懸液的制備與測定

菌懸液濃度為107CFU·mL-1，避光培養溫度為37 ℃，于600 nm 處測定吸光值。

1.2.4 青花椒提取物對金黃色葡萄球菌抑制作用研究

（1）抑菌圈的測定。在培養基凝固后，每皿加入1 mL 菌懸液進行平板涂布，而后沿同一方向等距離貼上濾紙片，濾紙片所加青花椒提取物為10 μL，無菌水為對照組，設置4 個實驗組，將青花椒提取物稀釋成30 mg·mL-1、60 mg·mL-1、120 mg·mL-1和240 mg·mL-1，培養24 h 后十字交叉法測量抑菌圈大小，每組3 個平行。

（2）青花椒提取物最小抑菌濃度的測定。最小抑 菌 濃 度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）測 定 方 法 參 考ABREU 等[4]和BEEVI 等[5]的 方法，以空白培養基為對照組，設置4 個實驗組，以107CFU·mL-1菌液作為稀釋液，將青花椒提取物配制成40 mg·mL-1、50 mg·mL-1、60 mg·mL-1和70 mg·mL-1，每組3 個平行。分別取稀釋后不同濃度的青花椒提取物，以每 孔200 μL 加入96 孔板，培養24 h 后600 nm 處測定吸光值[6]。MIC 計算公式為

（3）青花椒提取物最小殺菌濃度的測定。最小殺菌 濃 度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）測定方法參考李靜慧[7]和郭雪梅[8]的方法，即青花椒提取物抑制99.9%的金黃色葡萄球菌生長所需的濃度[9]。以空白培養基為對照組，設置4 個實驗組，以107CFU·mL-1菌液作為稀釋液，將青花椒提取 物 配 制 成60 mg·mL-1、70 mg·mL-1、80 mg·mL-1和90 mg·mL-1，每組3 個平行。分別取稀釋后不同濃度的青花椒提取物，以每孔200 μL 加入96 孔板，培養24 h 后檢測600 nm 處的吸光值。同時每孔取50 μL 培養液加入營養肉湯瓊脂培養基進行平板涂布，37 ℃避光培養24 h，計數菌落，最終選擇抑菌率≥99.9%，且平板涂布培養后菌落數≤5 CFU 所對應的青花椒提取物濃度為該供試菌的MBC 值[10]。MBC 計算公式為

（4）生長抑制曲線的測定。參考陳屹[11]、張雅靜[12]和李冬冬[13]的方法，以菌懸液為對照組，設置3 個實驗組，以107CFU·mL-1菌液作為稀釋液，將青花椒提取物配制成50 mg·mL-1、70 mg·mL-1、80 mg·mL-1，每組3 個平行。分別取稀釋后不同濃度的青花椒提取物，以每孔200 μL 加入96 孔板，每2 h 檢測一次600 nm 處的吸光值，測定金黃色葡萄球菌的生長情況[14]。

（5）青花椒提取物對金黃色葡萄球菌膜通透性的影響。以菌懸液為對照組，設置4 個實驗組，以107CFU·mL-1菌液作為稀釋液，將青花椒提取物配制成50 mg·mL-1、60 mg·mL-1、70 mg·mL-1和80 mg·mL-1，于80 r·min-1避光培養6 h，5 000 r·min-1離心5 min，收集細胞上清液，按照鉀離子檢測盒說明書測定金黃色葡萄球菌細胞上清液中鉀離子的含量。

（6）青花椒提取物對金黃色葡萄球菌內容物的影響。菌懸液為對照組，設置2 個實驗組，以107CFU·mL-1菌液作為稀釋液，將青花椒提取物配制成50 mg·mL-1、70 mg·mL-1，于100 r·min-1避光培養，每2 h 取 一 次 樣，培 養 結 束 后5 000 r·min-1離 心5 min，收集上清，260 nm 處檢測吸光值。

2 結果與分析

2.1 抑菌圈的測定結果

由表1 可知，青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后，均能產生一定大小的抑菌圈。

表1 青花椒提取物對金黃色葡萄球菌抑菌效果的測定

2.2 青花椒提取物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度

由圖1 可知，當青花椒提取物濃度為60 mg·mL-1時，抑菌率為79.45%；當青花椒提取物濃度為70 mg·mL-1時，抑菌率為97.59%，大于90%。因此，青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后MIC 值為70 mg·mL-1。

圖1 不同濃度青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度

2.3 青花椒提取物對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度

由圖2、表2 可知，當青花椒提取物濃度為80 mg·mL-1時，抑菌率≥99.9%，且平板涂布培養后菌落數≤5 CFU。因此，青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后MBC 值為80 mg·mL-1。

圖2 不同濃度青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度

表2 不同濃度青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌的菌落計數

2.4 青花椒提取物對金黃色葡萄球菌的生長抑制曲線

由圖3 可知，青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后對其生長均有抑制作用。

圖3 青花椒提取物對金黃色葡萄球菌的生長抑制曲線

2.5 青花椒提取物對金黃色葡萄球菌細胞膜通透性的影響情況

青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后，檢測細胞上清液中鉀離子含量，以此反映青花椒提取物作用下金黃色葡萄球菌細胞膜的通透性。根據試劑盒說明書，繪制鉀離子標準曲線，y=1.483 8x-0.023 7，R2=0.998 9，如圖4 所示。由圖5 可知，青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后，80 mg·mL-1對金黃色葡萄球菌膜的通透性影響最大，表明K+泄漏到胞外培養液中，青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后，增加了細胞膜的通透性。

圖4 鉀離子標準曲線

圖5 金黃色葡萄球菌膜通透性情況

2.6 青花椒提取物對金黃色葡萄球菌內容物泄露量的影響

檢測260 nm 處的吸光值，判斷青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后內容物的泄露量。由圖6 可知，青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后，70 mg·mL-1時內容物泄露最多，其次是50 mg·mL-1，表明青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌后破壞了細胞膜的完整性，導致胞內物質發生泄露。

圖6 青花椒提取物對金黃色葡萄球菌內容物泄露量的影響

3 結論

本研究將青花椒提取物作用于金黃色葡萄球菌，探究青花椒提取物的抑菌活性，結果顯示，菌體緩慢生長，MIC 為70 mg·mL-1，MBC 為80 mg·mL-1，鉀離子、內容物發生不同程度的泄露，表明青花椒提取物對金黃色葡萄球菌具有抑制作用。