食品中霉菌和酵母計數的不確定度評定

魏 敏，姜華軍，王言爽，程 丞

（威海市食品藥品檢驗檢測研究院，山東威海 264210）

霉菌和酵母菌都屬于真菌類，在自然界中廣泛分布。當食品受到霉菌和酵母菌污染時，易發生霉壞變質。很多種類的霉菌能夠產生有毒的代謝產物，從而引起急性或慢性中毒，特別是黃曲霉毒素等真菌毒素具有很強的致癌性[1]。在食品微生物學中，霉菌和酵母計數是重要的指示菌指標，可用于評價食品的被污染程度，在乳制品、飲料、糕點等多個產品類別的食品安全國家標準中都制定有霉菌或霉菌和酵母菌總數的限量要求[2-5]。為進一步加強本實驗室的質量管理，評價本實驗室的檢測能力，本實驗室參加了面粉中霉菌和酵母菌計數檢驗能力驗證，并進行測量不確定度的評定，以進一步提高霉菌和酵母計數檢測結果的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鈉，天津市致遠化學試劑有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基，北京路橋技術股份有限公司；面粉中霉菌和酵母菌計數能力驗證樣品，中國食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器與設備

電 子 天 平（XPR1202S）， 瑞 士METTLER TOLEDO 公司；拍擊式均質器（Bagmixer 400SW），法國Interscience 公司；霉菌培養箱（MI-250A），美國STIK 公司；生物安全柜（AB2-4S1），新加坡ESCO 公司；立式壓力蒸汽滅菌器（HVE-50），日本Hirayama 公司。

1.3 實驗方法

按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》（GB 4789.15—2016）第一法霉菌和酵母平板計數法進行能力驗證樣品的檢測[6]。

量取225 mL 無菌生理鹽水置于均質袋中，在生物安全柜內打開能力驗證樣品的西林瓶，將樣品加入均質袋，同時加入25 g 對應的面粉基質，拍擊均質1 min，得到1 ∶10 樣品勻液。吸取1 mL 1 ∶10樣品勻液，注于9 mL 無菌生理鹽水中，混勻制成1 ∶100 樣品勻液。按上述步驟，依次進行10 倍系列稀釋。選擇2 個適宜稀釋度，從每個稀釋度的樣品勻液中分別吸取1 mL 加入2 個無菌培養皿，空白對照為吸取1 mL 無菌生理鹽水加入2 個無菌培養皿。將融化的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基冷卻至46 ℃，立即傾注約25 mL 于每個培養皿中，混合均勻。瓊脂凝固后將平板正置，放入28 ℃霉菌培養箱中培養5 d，觀察并報告檢測結果。

2 結果與分析

2.1 建立數學模型

待測樣品中霉菌和酵母菌總數的計算公式為

則樣品制備引入的相對標準不確定度為

式中：T為待測樣品中霉菌和酵母菌總數，CFU·g-1；C為某一稀釋度的1 個平板中霉菌和酵母的菌落數之和，CFU；V為樣品勻液加樣體積，mL；d為稀釋因子，g·mL-1。

2.2 不確定度分量的來源分析

霉菌和酵母計數的不確定度來源主要有樣品制備urel(P)、樣品稀釋urel(D)、加樣過程urel(S)和重復性測量urel(R)。

2.3 不確定度分量的評定

2.3.1 樣品制備引入的相對標準不確定度urel(P)

本實驗稱取25.00 g 能力驗證面粉樣品，加入到225 mL 無菌生理鹽水中，不確定度主要來源于稱量面粉樣品時電子天平引入的不確定度和量取無菌生理鹽水稀釋液時量筒引入的不確定度。

所用電子天平感量為0.01 g，根據《電子天平檢定規程》（JJG 1036—2008）[7]，其最大允許誤差為±0.05 g，按均勻分布，

2.3.2 樣品稀釋引入的不確定度urel(D)

本實驗依次吸取1 mL 不同稀釋度的樣品勻液加入9 mL 無菌生理鹽水中進行10 倍系列稀釋，吸取樣品勻液和生理鹽水分別用到1 mL 和10 mL 吸量管，因此不確定度主要來源于移取液體時吸量管引入的不確定度。根據JJG 196—2006[8]，1 mL 和10 mL 吸量管的容量允差分別為±0.008 mL 和±0.05 mL，按均勻分布，其標準不確定度分別為

則樣品稀釋時1 mL 和10 mL 吸量管引入的相對標準不確定度分別為

每稀釋一次需分別使用一次1 mL 和10 mL 吸量管，本實驗采用1 ∶100 稀釋度的平板進行霉菌和酵母計數，即只進行了一次稀釋。樣品稀釋引入的相對標準不確定度為，則稱量樣品時電子天平引入的標準不確定度為

稱量樣品時電子天平引入的相對標準不確定度為

2.3.3 加樣過程引入的不確定度urel(S)

本實驗加樣過程是用1 mL 吸量管分別吸取1 mL 樣品勻液加入2 個培養皿中，1 mL 吸量管引入的不確定度計算方法同2.3.2。加樣過程引入的相對標準不確定度為

所用量筒容量為250 mL，根據《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196—2006）[8]，其容量允差為±2.0 mL，按均勻分布，，則量取稀釋液時量筒引入的標準不確定度為

量取稀釋液時量筒引入的相對標準不確定度為

2.3.4 重復性測量引入的不確定度urel(R)

在相同的實驗條件下，由同一名檢驗人員對能力驗證樣品中的霉菌和酵母總數重復檢測20 次，20 次檢測結果的平均值以X—表示，結果見表1。由于檢測結果有很大的發散性，若直接計算樣本標準差，所得到的不確定度很大。本研究將重復檢測的結果均轉換為以10 為底的對數值后再進行不確定度的計算[9-11]。

表1 能力驗證樣品中霉菌和酵母計數重復檢測結果

用貝塞爾公式計算標準差，得到樣品重復性測量引入的相對標準不確定度為

2.4 相對合成標準不確定度

根據以上各不確定分量的評定結果進行不確定度的合成，霉菌和酵母計數的相對合成標準不確定度為

[6] 國家衛生和計劃生育委員會.食品安全國家標準食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數:GB 4789.15—2016[S].北京:中國標準出版社,2016.

[7] 國家質量監督檢驗檢疫總局.電子天平檢定規+0程 規u5r2 程e:6 l J(3JDG:2

[ J8+)J] 1G+00國.3u1069r2家e0—l66(— 質S25)023量+002 80u+監[6r2Se0[l S] 督(.. 0R] 北.1檢)北2京 驗7京0:檢2 中:=中疫0國.國0總質1計6局檢 量2出.3常 出版版用社社玻,2璃,02 00量80.6器.檢定

[9] 趙玲,王邱,王冰,等.飲料中霉菌和酵母計數檢驗結果的不確定度評估[J].食品安全質量檢測學報,2016,7(12):4749-4752.

2.5 擴展不確定度

根據JJF 1059.1—2012[12]，取置信概率p=95%，自由度ν=19，查詢t分布表得到包含因子k=2.09，擴展不確定度為

2.6 結果報告

樣品中霉菌和酵母計數檢測結果的對數值為lgX=3.668 4±0.033 9，取反對數之后得到霉菌和酵母計數檢測結果為4 310 ～5 038 CFU·g-1，修約后為4 300 ～5 000 CFU·g-1。

3 結論

本研究按照GB 4789.15—2016 進行面粉中霉菌和酵母計數能力驗證樣品的檢測，并對測量不確定度進行評定。不確定度主要來源于樣品制備、樣品稀釋、加樣過程和重復性測量。從評定結果來看，對霉菌和酵母計數不確定度貢獻最大的是樣品重復性測量引入的不確定度。重復性測量引入的不確定度屬于A 類不確定度，受檢測人員、實驗環境、樣品均勻性等因素的影響。實驗室可從多方面加強質量控制，降低不確定度，確保檢測結果準確、可靠。