柱前衍生化HPLC 法測定植物水解蛋白中的17 種氨基酸

陳建芳，江學(xué)文，梁 科，王瑩瑩

（1.華南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510631；2.廣東達元綠洲食品安全股份有限公司，廣東廣州 510631）

醬油是我國傳統(tǒng)調(diào)味品，根據(jù)《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2717—2003），醬油分為釀造醬油和配制醬油[1]。釀造醬油是以大豆或脫脂大豆、小麥或麩皮為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵釀制成的具有特殊色、香、味的液體調(diào)味品[2]。配制醬油是以釀造醬油為主體，與酸水解植物蛋白調(diào)味液、食品添加劑等配制而成的液體調(diào)味品[3]。酸水解植物蛋白調(diào)味液（Hydrolyzed Vegetable Protein，HVP）是指以含有食用植物蛋白的脫脂大豆、花生粕、小麥蛋白或玉米蛋白為原料，經(jīng)鹽酸水解、堿中和制成的液體鮮味調(diào)味品[4]。酸水解植物蛋白調(diào)味粉（HVP 粉）是HVP 經(jīng)離心噴霧干燥而制成。根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 醬油》（GB 2717—2018），醬油是指釀造醬油[5]。2021 年6 月，國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布《關(guān)于加強醬油和食醋質(zhì)量安全監(jiān)督管理的公告》，指出醬油生產(chǎn)企業(yè)不得再生產(chǎn)銷售標(biāo)示為“配制醬油”的產(chǎn)品，不得使用酸水解植物蛋白調(diào)味液等原料配制生產(chǎn)醬油。但不法商人為獲取更多利益，使用配制醬油冒充釀造醬油，給消費者帶來安全風(fēng)險，因此鑒別釀造醬油和配制醬油具有重要的現(xiàn)實意義。本研究利用2,4-二硝基氟苯柱前衍生HPLC 法測定HVP 中游離氨基酸，以期為釀造醬油與配制醬油的鑒別提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸水解植物蛋白粉（HVP 粉），上海愛普食品工業(yè)有限公司（以下簡稱愛普HVP 粉）；酸水解植物蛋白粉（HVP 粉），河南新鄉(xiāng)科興添加劑有限責(zé)任公司（以下簡稱科興HVP 粉）；復(fù)合酸水解植物蛋白調(diào)味液（HVP），保定味佳調(diào)味品有限公司（以下簡稱味佳HVP）；廚邦醬油特級鮮生抽（釀造醬油）、海天金標(biāo)生抽（釀造醬油）、李錦記精選老抽（釀造醬油）、海天鮮味生抽（釀造醬油），購于超市；17 種氨基酸混標(biāo)，購自中國計量研究院，濃度為1.0 mmol·mL-1；17 種氨基酸單標(biāo)，上海麥克林生化科技有限公司；2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，Agilent 1260，美國Agilent 公司；DiamonsilAAA 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），北京迪科馬科技有限公司；數(shù)控超聲波清洗器，KH-500B，昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，HHS-11-2，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；循環(huán)水真空泵，SHZ-D（III），鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備：用0.1 mol·L-1稀鹽酸將17 種氨基酸混標(biāo)溶液（每種氨基酸濃度均為1.0 mmol·L-1）稀釋成不同濃度梯度的混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品處理

用水將HVP 粉稀釋30 倍后，再用0.1 mol·L-1鹽酸將其稀釋5 倍；用水將HVP 和醬油稀釋10 倍后，再用0.1 mol·L-1鹽酸將其稀釋5 倍。

1.3.3 衍生化

吸取100 μL 氨基酸混標(biāo)溶液、HVP 處理液或醬油稀釋液，加入2 mL 離心管中，加入100 μL 0.1 mol·L-1Na2B4O7水 溶 液 和100 μL 1% DNFB 乙腈溶液，蓋緊搖勻，于60 ℃恒溫水浴鍋中避光反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢后將試管置于冷水中冷卻，加入0.02 mol·L-1Na2HPO4和0.02 mol·L-1NaH2PO4水溶液定容至1 mL，混勻后，用0.45 μm 有機膜過濾，待測。

1.3.4 儀器條件

色譜柱柱溫：45 ℃；檢測波長：360 nm；進樣體積：10 μL；流速：1.0 mL·min-1；流動相A 為0.02 mol·L-1Na2HPO4+0.02 mol·L-1NaH2PO4水溶液；流動相B 為甲醇∶乙腈=10 ∶90（V∶V）；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2019 軟件進行數(shù)據(jù)計算與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限測定結(jié)果

由圖1 可知，17 種氨基酸混標(biāo)溶液中各氨基酸能有效分離，峰型正常，表明色譜方法適合氨基酸的測定。以氨基酸對照品峰面積（y）對進樣氨基酸濃度（x，mg·L-1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。信噪比（S/N）計算檢出限和定量限，S/N=3 ∶1 時的氨基酸濃度為檢出限，S/N=10 ∶1 時的氨基酸濃度為定量限結(jié)果，見表2。除酪氨酸相關(guān)系數(shù)大于0.99 外，其余氨基酸相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.110 ～1.812 mg·L-1，定量限為0.329 ～3.624 mg·L-1，表明儀器靈敏度高。

圖1 17 種氨基酸混標(biāo)色譜圖

表2 17 種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.2 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收實驗結(jié)果

2.2.1 精密度實驗結(jié)果

精密吸取氨基酸混合對照品溶液（0.25 mmol·mL-1），連續(xù)進樣6 次，測定各氨基酸的含量并計算其RSD。測得天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、精氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和酪氨酸含量的RSD 分別為1.87%、0.20%、0.42%、0.34%、0.30%、1.74%、0.28%、0.25%、0.19%、0.18%、0.11%、0.54%、0.49%、0.48%、0.22%、0.31%和1.02%，說明該儀器精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性實驗結(jié)果

分別稱取6 份愛普HVP 粉，按“1.3.2”和“1.3.3”制備溶液并衍生化，在“1.3.4”色譜條件下連續(xù)進樣6 次，測定各種氨基酸的含量并計算其RSD，愛普HVP 粉色譜圖見圖2。測得愛普HVP 粉天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、精氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和酪氨酸含量的RSD 分別為4.11%、4.21%、3.44%、2.75%、0.44%、0.57%、1.50%、2.53%、3.64%、3.86%、1.28%、0%、6.07%、3.97%、3.63%、2.46%、1.85%，說明該方法重復(fù)性良好。

圖2 愛普HVP 粉色譜圖

2.2.3 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

分別稱取3 份愛普HVP 粉，按“1.3.2”和“1.3.3”制備溶液并衍生化，在“1.3.4”色譜條件下，分別于0 h、24 h、48 h 進樣測定，記錄峰面積，計算氨基酸含量及其RSD。測得愛普HVP 粉天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、精氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和酪氨酸含量的RSD 分別為4.62%、3.13%、3.96%、4.46%、1.51%、2.79%、2.63%、3.32%、1.33%、4.09%、2.15%、3.24%、3.74%、3.58%、1.64%、1.51%、1.10%，表明樣品在室溫條件下48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 加標(biāo)回收實驗結(jié)果

稱取3 份愛普HVP 粉，精密加入與樣品中待測成分含量相當(dāng)?shù)陌被峄旌先芤海础?.3.2”和“1.3.3”制備溶液并衍生化，按“1.3.4”色譜條件測定，計算氨基酸含量并計算其RSD。由表3 可知，愛普HVP 粉17 種氨基酸的平均加標(biāo)回收率為86.17%～105.81%，RSD 為0.15%～9.39%，說明該方法準(zhǔn)確度高。

表3 加標(biāo)回收實驗結(jié)果（n=3）

2.3 植物水解蛋白與釀造醬油氨基酸測定結(jié)果對比

由表4 可知，HVP 粉和HVP 氨基酸組成相似，其中谷氨酸占比相差較大，是因為HVP 粉中加入了谷氨酸鈉。HVP（粉）氨基酸組成與釀造醬油差異明顯，均以谷氨酸占比最高，這與原料中蛋白質(zhì)的氨基酸比例有關(guān)，有研究表明，大豆和豆粕蛋白質(zhì)中谷氨酸含量均最高[6-7]。HVP（粉）中谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸以及脯氨酸百分含量與釀造醬油差異較大，HVP（粉）中谷氨酸占比均低于45%，釀造醬油中谷氨酸含量均超過45%，尤其是廚邦醬油特級鮮生抽谷氨酸占比達75.01%；HVP（粉）中天冬氨酸占比均超過7%，而釀造醬油中天冬氨酸的占比均低于5%，尤其是廚邦醬油特級鮮生抽中天冬氨酸含量僅為1.11%；HVP（粉）中精氨酸占比均超過4.5%，尤其是味佳HVP 液中精氨酸占比高達11.24%，而釀造醬油中精氨酸的占比均低于2.5%；HVP（粉）中甘氨酸占比均超過3.5%，而釀造醬油中甘氨酸的占比均低于1.7%；HVP（粉）中脯氨酸占比均超過5%，尤其是味佳HVP 液中脯氨酸占比高達9.74%，而釀造醬油中脯氨酸的占比均低于2.5%。HVP（粉）中天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸和脯氨酸含量較高，與它們在原料豆粕中的高含量及它們在HVP 中的釋放率高于90%有關(guān)[6-8]。

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了2,4-二硝基氟苯-柱前衍生HPLC法測定HVP 中17 種氨基酸含量的方法，該方法操作簡便，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度高，可作為HVP 中氨基酸含量的測定方法。植物水解蛋白與釀造醬油中的氨基酸組成差異較大，尤其是谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸以及脯氨酸，植物水解蛋白中谷氨酸占比低于釀造醬油，而天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸以及脯氨酸明顯高于釀造醬油，可為釀造醬油與配制醬油的鑒別提供一定依據(jù)。