UPLC-MS/MS 測定茶葉中草甘膦、草銨膦及氨甲基膦酸殘留量

文洋洋

（六安市產品質量監(jiān)督檢驗所，安徽六安 237000）

草甘膦（Glyphosate，PMG）是近些年應用最廣、產量最大的非選擇性廣譜除草劑，因其高效、廉價、低毒的特性被廣泛應用于花木、茶葉、果樹等領域[1]。草銨膦（Glufosinate ammonium，GLUF）具備與草甘膦類似的優(yōu)點，且因其為觸殺型農藥，比內吸型的草甘膦發(fā)揮作用速度更快，適用于對草甘膦產生抗性的地區(qū)，使用量也逐年增加。草甘膦在自然界和植物體內還會緩慢代謝，主要代謝產物有氨甲基膦酸（Aminomethyl Phosphonic Acid，AMPA）。草甘膦和草銨膦雖然屬于低毒性農藥，但其殘留問題仍可能對人體健康造成威脅[2]。我國《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）對茶葉中草甘膦和草銨膦殘留進行了規(guī)定，限量分別為1 mg·kg-1和0.5 mg·kg-1[3]。在實際檢驗工作中，茶葉中草甘膦、草銨膦殘留超標情況較為常見。

草甘膦、草銨膦以及代謝物氨甲基膦酸的極性均較強，微溶于有機溶劑，易溶于水，同時缺少熒光官能團，鑒于這些特性，目前實際檢測中最常用的檢測方法為液相色譜-串聯質譜法，但現有液質聯用法的提取凈化過程復雜、試劑消耗量大、衍生時間較長，特別是離子交換柱洗脫過程對人員操作要求較高，人員誤差較大[4-5]。筆者通過對提取凈化方式、衍生條件、LC-MS/MS 色譜系統(tǒng)等進行優(yōu)化，建立了一種同時檢測草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸3 種物質的超高效液相色譜-串聯質譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS），過程簡便、檢測速度快、結果穩(wěn)定，能滿足日常茶葉中3 種物質的檢測要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

Waters I-Class/Xevo-TQD 超高效液相色譜串聯質譜儀（Waters Corporation）；SE402F2H 電子天平（常州奧豪斯儀器公司）；控制型試管研磨機（艾卡廣州儀器設備公司）；KS-3200E 超聲清洗機（昆山潔力美超聲儀器公司）；Velocity 18R 高速冷凍離心機（Dynamica Pty Ltd）；D14UV 明澈超純水機（Merck Millipore Corporation）。

1.2 材料與試劑

標準品：水中草甘膦標準溶液、水中草銨膦標準溶液、水中氨甲基膦酸標準溶液、草甘膦同位素內標（水中1,2-13C215N 草甘膦），100 μg·mL-1，天津阿爾塔科技公司；甲酸、二氯甲烷、乙酸銨（上海阿拉丁生化科技公司，色譜純）；乙腈（賽默飛公司，色譜純）；芴甲氧羰酰氯（Fmoc-Cl，上海阿拉丁生化科技公司，色譜純）；硼酸鈉（國藥集團，分析純）；CNWBOND HC-C18SPE 小柱（上海安譜）。

1.3 溶液配制

標準儲備液：分別準確移取草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸標準品各0.5 mL 至10 mL 容量瓶，用一級超純水定容，混勻，配制成5.0 μg·mL-1儲備液，5 ℃下保存待用。

同位素內標1,2-13C215N 草甘膦溶液：用超純水稀釋內標標準溶液至1.0 μg·mL-1，5 ℃下保存待用。

系列標準工作溶液：準確移取草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸標準儲備液各2 mL，混勻稀釋成1 μg·mL-1的混合標準工作液。移取混合標準溶液100 μL、200 μL、500 μL、1 000 μL、2 000 μL、5 000 μL 至10 mL 容量瓶，加入100 μL 1.0 μg·mL-1內標溶液，超純水定容，得到濃度為10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1的系列標準工作溶液，其中內標濃度為10 ng·mL-1，現配現用。

30 g·L-1芴甲氧羰酰氯丙酮溶液：稱取0.3 g 芴甲氧羰酰氯，用丙酮溶解并定容至10 mL。

1.4 樣品前處理

稱取粉碎茶葉試樣1 g（精確至0.01 g）于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入300 μL 1.0 μg·mL-1內標溶液，加入超純水15 mL，浸泡30 min，再加入二氯甲烷10 mL，振蕩20 min，4 000 r·min-1離心10 min。上層水溶液轉移至另一離心管，再向殘渣離心管中加入超純水15 mL 復提一次，合并兩次水溶液，混合充分。C18SPE 小柱經乙腈、水依次活化后，先加入1.0 mL 提取液過柱棄去濾液，再加入4.0 mL 提取液過柱，收集濾液。取凈化后樣液1.0 mL 加入5%硼酸鹽緩沖溶液200 μL、30 g·L-1芴甲氧羰酰氯丙酮溶液200 μL，混勻，30 ℃下避光衍生6 h。衍生后溶液過0.45 μm 水相濾膜后，進行UPLC-MS/MS測定。混合標準工作液與樣品同樣方法進行衍生操作。

1.5 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A：含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸銨溶液；流動相B：含0.1%甲酸的乙腈；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流動相洗脫程序見表1。

表1 流動相洗脫程序

（2）質譜條件。離子源：ESI 電噴霧離子源，正離子掃描；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流速：1 000 L·Hr-1；離子源溫度：150 ℃；毛細管電壓：3.2 kV；掃描方式：MRM 多反應監(jiān)測；離子對信息見表2。

表2 草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸質譜離子對信息

2 結果與分析

2.1 提取與凈化方式的選擇

2.1.1 提取溶劑選擇

草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸的極性均較強，難溶于正己烷、甲苯、二氯甲烷等有機溶劑，易溶于水，通過比較乙腈水、甲醇水、超純水3 種提取溶劑，發(fā)現超純水提取效率最高，同時加入二氯甲烷除去提取液中色素等脂溶性雜質[6-7]。

2.1.2 凈化材料選擇

在提取液凈化方面，現有行業(yè)標準一般選用CAX 陽離子交換柱進行凈化，但此方法需要調節(jié)提取液pH 值，試劑消耗大，且操作較煩瑣。由于草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸的極性均較強，本文嘗試選擇C18、GCB、HLB、NH24 種反相固相萃取柱，采用保留干擾物方式對提取液進行凈化，發(fā)現使用C18SPE 小柱凈化，回收率較高且成本較低，故選擇C18SPE 固相萃取柱作為本方法的凈化柱。

2.2 衍生條件與時間的優(yōu)化

2.2.1 衍生試劑濃度選擇

配制濃度為1 ～50 g·L-1的芴甲氧羰酰氯Fmoc-Cl 作為衍生試劑，分別進行衍生試驗，比較衍生效果。隨著衍生試劑濃度的不斷增大，衍生物響應增強，峰形更加對稱、尖銳，但過量的衍生化試劑會產生大量沉淀，影響通過濾膜的速度，也容易污染儀器。因此，本文選擇30 g·L-1Fmoc-Cl 作為衍生試劑[8]。

2.2.2 衍生時間優(yōu)化

在選定的衍生條件下，進行不同衍生反應時長的試驗，結果表明不同衍生時間（2 ～12 h）對草甘膦、草銨膦及氨甲基膦酸的衍生效果有較明顯的影響，衍生物回收率隨著衍生反應時間的延長而提高，當衍生反應時間達到6 h 后，繼續(xù)延長衍生時間效果不明顯。綜合考慮實驗效率，將衍生時間確定為6 h。

2.3 色譜柱的選擇

衍生反應后，Fmoc-基團被引入草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸分子，C18色譜柱對其有較好的保留能力[9-10]。本實驗分別使用ACQUITY UPLC? HSS T3柱（ 50 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC?BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Kinetex?C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、ZORBAX Eclipse Plus C18柱（ 50 mm×2.1 mm，1.8 μm）4 種型號色譜柱進行茶葉中草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸分離效果的測試。結果發(fā)現使用ACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱所得峰形的對稱性和集中性最好，分析原因可能是該色譜柱使用BEH 亞乙基橋雜化顆粒技術，與常規(guī)的硅膠基質顆粒相比，能夠控制硅醇活性以獲得更好的響應、峰形和柱效。而使用其他色譜柱拖尾現象較嚴重、分離效果不理想。因此，選擇ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱作為液相色譜系統(tǒng)分離柱。

2.4 方法學驗證

2.4.1 方法線性、測定低限

配制系列混合標準工作液（10 ～500 ng·mL-1）與樣品同樣方法進行衍生操作，使用相同的儀器條件進行測試，分別進樣，內標法定量，繪制標準工作曲線，線性方程及相關系數見表3。3 種化合物在10 ～500 ng·mL-1線性關系良好，相關系數R2均大于0.995。利用儀器信噪比S/N=3 時的進樣濃度，計算得到草甘膦、草銨膦及氨甲基膦酸3 種化合物的測定低限均為50 μg·kg-1。

表3 線性方程及相關系數

2.4.2 回收率、精密度

選取不同空白茶葉基質（綠茶、黃茶、紅茶、花茶），添加不同濃度的草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸混合標準溶液，添加水平為0.05 mg·kg-1（加標1）、0.10 mg·kg-1（加標2）、1.00 mg·kg-1（加標3），按照上述實驗方法，平行測定6 次，并做空白對照。草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸的回收率和相對標準偏差結果見表4。結果顯示，草甘膦的平均回收率為80.8%～94.3%，相對標準偏差（n=6）為2.6%～7.1%；草銨膦的平均回收率為82.0%～95.1%，相對標準偏差（n=6）為2.4%～7.3%；氨甲基膦酸的平均回收率為83.1%～95.5%，相對標準偏差（n=6）為1.9%～8.2%。表明實驗回收率滿足檢測要求、重復性較好。

表4 方法的回收率和精密度（n=6）

2.4.3 實際樣品檢測

使用本方法對市售茶葉進行檢測，包括綠茶20 組、黃茶15 組、紅茶5 組、花茶5 組。其中綠茶草甘膦檢出2 組、黃茶草甘膦檢出1 組，但未超出限量值（GB 2763—2021 規(guī)定茶葉中草甘膦限量為1 mg·kg-1），其余均未檢出。

3 結論

本實驗建立了采用UPLC-MS/MS 測定茶葉中草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸農藥殘留的方法，從提取與凈化方式、衍生條件、色譜柱等方面進行優(yōu)化調整，最終選用純水作為提取溶劑，并用二氯甲烷除去部分脂溶性雜質，經C18SPE 小柱吸附凈化后，在5%硼酸鹽緩沖環(huán)境下與芴甲氧羰酰氯Fmoc-Cl 衍生反應，生成利于液質聯用儀檢測的衍生物。本方法操作簡便、試劑消耗量少，有利于控制人員操作誤差、提高檢測效率。利用本方法對市售茶葉及代用茶樣品進行檢測，結果表明該方法定量準確、回收率重復性好，可用于茶葉中草甘膦等農藥殘留的日常檢測。