人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)分析中的應(yīng)用

雷 偉，李智偉，郭玉娟，擺文麗，芮東升，王 奎

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床檢測(cè)中心，新疆 烏魯木齊 830001）

流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種能夠?qū)腋〉募?xì)胞或微粒進(jìn)行快速而精確地分析和分選的檢測(cè)技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究及臨床診斷中[1-3]。FCM 應(yīng)用過程中會(huì)產(chǎn)生高維數(shù)據(jù)，傳統(tǒng)數(shù)據(jù)分析是基于設(shè)門的方法，通常分析者會(huì)在FlowJo 等可視化軟件中根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選擇測(cè)量通道繪制能夠代表細(xì)胞抗原表達(dá)水平的散點(diǎn)圖，在散點(diǎn)圖中圈出門以區(qū)分出不同的細(xì)胞亞群，以此得到疾病的相關(guān)信息。目前FCM 向多參數(shù)方向發(fā)展，給數(shù)據(jù)分析帶來巨大挑戰(zhàn)，基于人工設(shè)門的細(xì)胞分群方法的局限性日益顯著。首先，人工分群缺乏客觀性，由于沒有可量化的標(biāo)準(zhǔn)，不同分析者得到的結(jié)果可能存在差異；其次，人工分群過程繁瑣，重復(fù)性工作耗費(fèi)大量時(shí)間導(dǎo)致效率低下；此外，人工分群要求分析者有一定的專業(yè)知識(shí)，能夠根據(jù)經(jīng)驗(yàn)準(zhǔn)確設(shè)門和識(shí)別亞群，這可能是一般使用者不具備的[4-7]。因此，提出自動(dòng)分群方法，并已成為近年來國內(nèi)外研究熱點(diǎn)[8-11]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural network，ANN）是一種受到人腦神經(jīng)元的啟發(fā)而產(chǎn)生的多參數(shù)非線性計(jì)算模型，其具備了機(jī)器學(xué)習(xí)的能力，常被用于解決數(shù)據(jù)分析問題[12，13]。本研究旨在通過構(gòu)建ANN 模型實(shí)現(xiàn)在FCM 數(shù)據(jù)上的細(xì)胞自動(dòng)分群，并且同其他方法進(jìn)行比較，探究該方法應(yīng)用的可行性。

1 資料與方法

1.1 資料來源 數(shù)據(jù)來源于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床檢測(cè)中心2016-2017 年流式檢測(cè)存檔數(shù)據(jù)，包括10 名健康志愿者的骨髓標(biāo)本FCM 數(shù)據(jù)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①人員無發(fā)熱、咳嗽或其他不適；②血常規(guī)和生化檢測(cè)結(jié)果正常；③近期未使用過影響免疫功能的藥物；④體檢未發(fā)現(xiàn)免疫性疾病；⑤肝腎功能檢查正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有急性病毒感染性疾病、先天性免疫缺乏癥、獲得性免疫缺陷綜合征、霍奇金病、白血病、惡性腫瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥等疾病；②處于外科手術(shù)恢復(fù)和腫瘤化療期間從事輻射接觸工作、使用淄醇類藥物及免疫抑制劑的人員；③實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢測(cè)確診乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒者；④近期有飲酒情況（如酗酒）的對(duì)象；⑤近期獻(xiàn)血的對(duì)象。本項(xiàng)目已通過當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)，所有參與者均簽署知情同意書。檢測(cè)儀器為BD 公司的FACS Canto Ⅱ雙激光八色流式細(xì)胞儀，標(biāo)本中加入CD45 標(biāo)記分子與骨髓細(xì)胞結(jié)合，細(xì)胞在激光光源的照射下發(fā)射出代表細(xì)胞體積大小及粒度的散射光信號(hào)及代表細(xì)胞生化性質(zhì)的特異性熒光信號(hào)。提取前向散射光高度（FSC-H）、前向散射光面積（FSC-A）、側(cè)向散射光面積（SSC-A）及CD45 熒光強(qiáng)度。單個(gè)細(xì)胞被激發(fā)后產(chǎn)生的散射光和熒光信號(hào)以單個(gè)事件的形式被記錄下來，所有的事件匯聚成被測(cè)細(xì)胞群完整的FCM 數(shù)據(jù)，以FCS 格式存儲(chǔ)。

1.2 人工設(shè)門分析方法 在FlowJo 分析軟件中打開FCS 文件，以FSC 和SSC 為坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，其中FSC 反映細(xì)胞粒徑，SSC 反映細(xì)胞復(fù)雜度，結(jié)合兩者可以排除凋亡細(xì)胞和細(xì)胞碎片，得到有核細(xì)胞群體。在有核細(xì)胞群體中單細(xì)胞的FSC-H 和FSC-A 呈線性相關(guān)，故可在散點(diǎn)圖中用直線劃定范圍區(qū)分單細(xì)胞和黏連細(xì)胞。在單細(xì)胞群中繪制以CD45 和SSC為坐標(biāo)的散點(diǎn)圖，根據(jù)細(xì)胞聚類特征并結(jié)合經(jīng)驗(yàn)圈出不同亞群的邊界，通常包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、有核紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和幼稚細(xì)胞等。在臨床檢驗(yàn)中，對(duì)CD45 和SSC 的設(shè)門是許多血液疾病診斷的初始策略，為區(qū)分主要的造血細(xì)胞群體提供一個(gè)有用的起點(diǎn)，可以結(jié)合其他標(biāo)記物進(jìn)行下一步診斷[14]。

1.3 ANN 分群模型

1.3.1 數(shù)據(jù)集準(zhǔn)備 采用R 4.0 中Bioconducter-flowcore 軟件包讀取數(shù)據(jù)[15]，對(duì)SSC 和CD45 分別使用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化和雙指數(shù)轉(zhuǎn)化進(jìn)行去偏態(tài)化。采用Python 3.7 中sklearn 軟件包的MinMaxScaler 函數(shù)對(duì)納入的變量進(jìn)行歸一化，使變量范圍在[0，1]之間。以人工分群結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，賦予數(shù)據(jù)標(biāo)簽（0：淋巴細(xì)胞；1：單核細(xì)胞；2：幼稚細(xì)胞；3：嗜酸性粒細(xì)胞；4：中性粒細(xì)胞；5：有核紅細(xì)胞）。

1.3.2 模型架構(gòu)及運(yùn)算 采用Python 3.7 中keras 軟件包搭建ANN 模型，由輸入層、2 個(gè)隱含層、輸出層和分類器組成。輸入層有2 個(gè)節(jié)點(diǎn)，分別用于輸入CD45 和SSC，每個(gè)隱含層包括10 個(gè)神經(jīng)元，各層之間采用tanh 激活函數(shù)；輸出層有6 個(gè)節(jié)點(diǎn)，對(duì)應(yīng)6個(gè)細(xì)胞亞群，在輸出層后加入softmax 函數(shù)作為分類器，用來計(jì)算多分類概率。設(shè)置初始學(xué)習(xí)率為0.01，迭代次數(shù)為20，優(yōu)化器為隨機(jī)梯度下降法（SGD）。訓(xùn)練時(shí)，訓(xùn)練樣本在各層的神經(jīng)元間傳遞，向前傳播得到輸出值，網(wǎng)絡(luò)通過計(jì)算損失函數(shù)得到實(shí)際輸出與期望輸出間的殘差，再將殘差反向傳播回網(wǎng)絡(luò)中，逐層更新網(wǎng)絡(luò)中各層神經(jīng)元的權(quán)重和偏置，在迭代過程中損失函數(shù)逐漸下降，網(wǎng)絡(luò)參數(shù)趨于穩(wěn)定，訓(xùn)練結(jié)束后將模型以h5 文件存儲(chǔ)。

1.3.3 模型驗(yàn)證 采用交叉驗(yàn)證的方式，每個(gè)樣本依次作為測(cè)試集，未被選中的樣本合并后作為訓(xùn)練集。分別在各訓(xùn)練集進(jìn)行模型訓(xùn)練，計(jì)算模型在各測(cè)試集上的準(zhǔn)確率，計(jì)算平均準(zhǔn)確率和置信區(qū)間，并繪制混淆矩陣，并計(jì)算各亞群的F1 值，計(jì)算方法為：

式中，P 代表精度，R 代表召回率，F(xiàn)1 值是綜合評(píng)價(jià)模型識(shí)別能力的指標(biāo)，值越接近1 代表模型識(shí)別效果越好。

1.4 其他分群方法 決策樹和K-means 分別作為有監(jiān)督和無監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)的代表算法之一，被用于亞群分群中[7，8]。

1.4.1 決策樹分類算法 決策樹算法是一種逼近離散函數(shù)值的方法，可以在已知各種情況發(fā)生概率的基礎(chǔ)上對(duì)未知情況做出評(píng)價(jià)。每個(gè)決策樹都表述了一種樹型結(jié)構(gòu)，由它的分支來對(duì)該類型的對(duì)象依靠屬性進(jìn)行分類。每個(gè)決策樹可以依靠對(duì)源數(shù)據(jù)庫的分割進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)試，這個(gè)過程可以遞歸式的對(duì)樹進(jìn)行修剪，當(dāng)不能再進(jìn)行分割或一個(gè)單獨(dú)的類可以被應(yīng)用于某一分支時(shí)，則完成了遞歸過程，訓(xùn)練好的決策樹可以直接用于對(duì)新樣本的分類。

1.4.2 K-means 聚類算法 K-means 算法是一種基于迭代求解原理的聚類算法，其通過距離作為聚類參照的指標(biāo)，首先隨機(jī)選取數(shù)據(jù)中的若干對(duì)象作為聚類中心，然后計(jì)算其他每個(gè)對(duì)象和這些聚類中心的距離，并把每個(gè)對(duì)象分配給最近的聚類中心，每分配一個(gè)對(duì)象時(shí)，聚類中心則被重新計(jì)算，直到最后一個(gè)對(duì)象被分。為盡可能將亞群區(qū)分，研究中設(shè)置簇個(gè)數(shù)為10，略大于目標(biāo)亞群數(shù)，聚類后人工合并和識(shí)別亞群，給予相應(yīng)標(biāo)簽。

2 結(jié)果

2.1 ANN 模型訓(xùn)練過程 訓(xùn)練時(shí)，損失函數(shù)在迭代過程中逐漸下降，表明模型能夠從訓(xùn)練集中學(xué)習(xí)到有用的特征。同時(shí)，準(zhǔn)確率隨之提高并趨于穩(wěn)定，逐漸接近于1，說明模型在訓(xùn)練集上擬合良好，見圖1。

圖1 ANN 模型訓(xùn)練中準(zhǔn)確率和損失函數(shù)變化圖

2.2 ANN 模型分群結(jié)果 以SSC-A 和CD45 為坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，可知ANN 模型能夠區(qū)分細(xì)胞亞群，在亞群輪廓上與人工設(shè)門結(jié)果基本一致，見圖2；混淆矩陣顯示，ANN 模型對(duì)于各類細(xì)胞亞群均有較高的識(shí)別精度，見圖3。

圖2 人工分群方法和ANN 分群結(jié)果比較

圖3 混淆矩陣

2.3 三種自動(dòng)分群方法比較 以人工設(shè)門結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)ANN 模型、K-means 模型和決策樹模型自動(dòng)分群方法進(jìn)行相同的交叉驗(yàn)證，計(jì)算各亞群的F1 值和總體分群準(zhǔn)確率，結(jié)果顯示ANN 和決策樹準(zhǔn)確率及在各亞群上F1 值均優(yōu)于K-means 模型，見表1。

表1 三種自動(dòng)分群方法分群結(jié)果

3 討論

隨著FCM 的廣泛應(yīng)用，目前最先進(jìn)的流式細(xì)胞儀可以檢測(cè)超過30 個(gè)參數(shù)[16]。檢測(cè)能力提升的同時(shí)也給基于人工設(shè)門的FCM 數(shù)據(jù)分析帶來挑戰(zhàn)，不斷有自動(dòng)分析方法被提出。Cheung M 等[17]對(duì)現(xiàn)有自動(dòng)分析方法進(jìn)行調(diào)查后指出，雖然一些方法已經(jīng)被證明在FCM 數(shù)據(jù)分析中有不錯(cuò)的效果，并已發(fā)布相關(guān)軟件包，但軟件的跨平臺(tái)使用問題依然難以解決。目前多數(shù)方法采用無監(jiān)督的機(jī)器學(xué)習(xí)實(shí)現(xiàn)亞群聚類，這種方法得到的分群結(jié)果需要分析者進(jìn)行人工識(shí)別，難以實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化。因此，進(jìn)一步探究新方法在FCM 數(shù)據(jù)分析中的應(yīng)用是十分必要的。

ANN 是一種受到人腦神經(jīng)元處理信息方式的啟發(fā)而產(chǎn)生的多參數(shù)非線性計(jì)算模型，其具備了機(jī)器學(xué)習(xí)和模式識(shí)別的能力，針對(duì)復(fù)雜的非線性關(guān)系問題，只需要預(yù)先給予正確的訓(xùn)練數(shù)據(jù)，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)就可以快速找到其中隱含的規(guī)律，從而得到最優(yōu)模型。目前，ANN 被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在輔助診斷、預(yù)測(cè)疾病預(yù)后等方面表現(xiàn)良好，為解決許多臨床問題提供了新思路[18-20]。本研究提出了一種基于ANN的細(xì)胞亞群分群方法，作為一種有監(jiān)督的機(jī)器學(xué)習(xí)，模型能夠自動(dòng)區(qū)分并識(shí)別細(xì)胞類型，避免了分析者的主觀性，具有客觀高效的特點(diǎn)。且經(jīng)過測(cè)試，ANN模型可以很好的復(fù)現(xiàn)人工設(shè)門的結(jié)果，對(duì)于設(shè)門中處于亞群交界處未被納入的細(xì)胞，ANN 模型也能將其合理分配，在聚類輪廓上與設(shè)門結(jié)果基本一致，可以作為人工設(shè)門的補(bǔ)充和替代。此外，本研究以人工設(shè)門結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)ANN 模型、K-means 模型和決策樹模型自動(dòng)分群方法進(jìn)行相同的交叉驗(yàn)證，計(jì)算各亞群的F1 值和總體分群準(zhǔn)確率，結(jié)果顯示三者總體分群準(zhǔn)確率分別為0.970、0.972 和0.899，且ANN 和決策樹在各亞群上F1 值均優(yōu)于K-means 模型。同時(shí)需要指出，在有監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)方法中，當(dāng)訓(xùn)練數(shù)據(jù)較少的情況下，ANN 模型表現(xiàn)一般低于或接近其他方法，但隨著數(shù)據(jù)量的增加，ANN模型明顯優(yōu)于其他方法，具有更大潛力[21]。另外，由于本研究中僅通過少量骨髓樣本產(chǎn)生的FCM 數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集，因此未能充分展現(xiàn)出ANN 模型的大數(shù)據(jù)優(yōu)勢(shì)。并且在本研究中僅以健康個(gè)體作為對(duì)象，如需驗(yàn)證模型在特定疾病上的表現(xiàn)，還需要收集更多患者的FCM 數(shù)據(jù)，以進(jìn)一步探究ANN 在FCM 數(shù)據(jù)自動(dòng)分析中的價(jià)值。

綜上所述，基于ANN 模型的FCM 數(shù)據(jù)細(xì)胞分群方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)骨髓細(xì)胞的自動(dòng)分群，證明了將ANN 應(yīng)用于FCM 數(shù)據(jù)分析中的可行性，可以為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。