基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥的作用機(jī)制

王敏潔，徐傳花

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院常州市中醫(yī)醫(yī)院婦科，江蘇 常州 213000）

盆腔炎性疾病后遺癥（sequelae of pelvic inflammatory disease，sequelae of PID）是盆腔炎性疾病（pelvic inflammatory disease，PID）的病變遺留，包括復(fù)發(fā)性盆腔炎、慢性盆腔痛、異位妊娠和不孕癥等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1]，長(zhǎng)期后遺癥的發(fā)生率很高。極大地影響了育齡婦女的生殖健康，降低了婦女的生活質(zhì)量。該病目前主要治療方法是聯(lián)合抗生素，但長(zhǎng)期使用抗生素面臨耐藥性增加、療效降低的風(fēng)險(xiǎn)[2]。因此，中醫(yī)藥治療盆腔炎性疾病后遺癥具有明顯優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)并沒有盆腔炎性疾病后遺癥的名稱記載。根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可分為“癥瘕”“婦女腹痛”“白帶”“月經(jīng)不調(diào)”“不孕”等類。根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，該病以血瘀為基礎(chǔ)。桂枝茯苓丸是《金匱要略》中的經(jīng)典方劑，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍五味藥組成，具有活血化瘀、消癥止痛、調(diào)理氣血的功效，為婦人宿有癥瘕病、癥留胞宮、妊娠胎動(dòng)不安、漏下不止的主方[3]。通過數(shù)據(jù)挖掘分析，張崴等[4]發(fā)現(xiàn)桂枝茯苓方在臨床應(yīng)用治療女性生殖系統(tǒng)疾病的文獻(xiàn)中排名靠前。然而，目前對(duì)桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥作用機(jī)制的研究尚少。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用數(shù)據(jù)挖掘方法分析藥物多成分、多靶點(diǎn)、多途徑之間的相互作用。本文利用數(shù)據(jù)可視化分析方法，預(yù)測(cè)了藥物在疾病治療中的作用機(jī)理，并利用該網(wǎng)絡(luò)研究了中藥的作用機(jī)理為相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 “桂枝茯苓丸”藥物化學(xué)成分及其相關(guān)靶點(diǎn)的收集 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database And Analysis Platform，TCMSP）搜索桂枝茯苓丸的有效成分，按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-like，DL）≥0.18 的標(biāo)準(zhǔn)篩選所有有效成分，將過濾過的化合物輸入U(xiǎn)niport 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）。確定物種為人（Human），范圍為已驗(yàn)證（Reviewed），尋找相應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，獲得遺傳基因名稱、Uniport ID 等信息。

1.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)與藥物—疾病交集靶點(diǎn) 通過人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)收集盆腔炎性疾病后遺癥的疾病靶點(diǎn)，使用的關(guān)鍵詞為“sequelae of PID”。收集到的目標(biāo)導(dǎo)入到UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化處理。將“桂枝茯苓丸”的有效成分相關(guān)的靶點(diǎn)和“盆腔炎性疾病后遺癥”的疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入到Venny 2.1.0 中，獲得藥物-疾病交叉靶點(diǎn)和Venn 圖。

1.3 藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 以桂枝茯苓丸的有效成分靶點(diǎn)和盆腔炎性后遺癥疾病靶點(diǎn)為基礎(chǔ)，構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病Excel 文件，導(dǎo)進(jìn)Cytoscape3.8.0 構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，從而查明桂枝茯苓丸及其活性成分、靶點(diǎn)與疾病的關(guān)系。

1.4 藥物-疾病蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將藥物和疾病的交叉靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 軟件（https://string-db.org/）中，物種僅局限于人（homo sapiens），查看并保留蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系≥0.4 數(shù)據(jù)，結(jié)果以TSV 格式導(dǎo)出，并使用Cytoscape 3.8.0 軟件建立蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO 生物功能及KEGG 信號(hào)通路富集分析 利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)藥物與疾病交叉靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書信號(hào)通路富集分析（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和基因本體生物學(xué)過程分析（gene ontology，GO）。將標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為P小于0.05，將P-value 最小的GO 生物功能及KEGG 信號(hào)通路前20 條結(jié)果制成氣泡圖進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 “桂枝茯苓丸”藥物化學(xué)成分及其相關(guān)靶點(diǎn) 利用TCMSP 進(jìn)行檢索，并設(shè)定OB≥30%、DL≥0.18，篩選得到桂枝茯苓丸組方藥物活性成分，其中桂枝7 個(gè)、茯苓15 個(gè)、牡丹皮11 個(gè)、白芍13 個(gè)、桃仁23 個(gè)，合并去重后共59 個(gè)。其中共有成分有7 個(gè)，見表1。借助TCMSP、Uniport 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，刪除沒有靶基因的成分23 個(gè)，最終獲得化學(xué)成分36 個(gè)，對(duì)應(yīng)候選靶點(diǎn)187 個(gè)，部分候選靶點(diǎn)見表2。

表1 桂枝茯苓丸中各個(gè)藥物的共有活性成分

2.2 “盆腔炎性疾病后遺癥”疾病靶點(diǎn)的搜集結(jié)果通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，獲得疾病靶點(diǎn)199 個(gè)。將桂枝茯苓丸藥物成分相關(guān)靶點(diǎn)、盆腔炎性疾病后遺癥疾病相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0在線作圖工具，共獲得38 個(gè)交集靶點(diǎn)及韋恩圖，見圖1。

圖1 桂枝茯苓丸-盆腔炎性疾病后遺癥交集靶點(diǎn)及韋恩圖

2.3 藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病Excel 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件并進(jìn)行映射，構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)共71 個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括1 個(gè)藥方節(jié)點(diǎn)、5 個(gè)藥物節(jié)點(diǎn)、26 個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)、38 個(gè)作用靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)及1 個(gè)疾病節(jié)點(diǎn)，164 條邊。利用Cytoscape軟件中的NetworkAnalyzer 分析工具得出有效成分的Degree 值，見表3。

圖2 桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

表3 桂枝茯苓丸藥物有效成分及OB、DL 值（Degree 值前7 位）

2.4 藥物-疾病蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將藥物-疾病的38 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 軟件中，設(shè)置置信度為Score≥0.400，導(dǎo)出TSV 數(shù)據(jù)文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件，共得到38 個(gè)節(jié)點(diǎn)，810 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為42.6，連接度越大，靶點(diǎn)越關(guān)鍵，見圖3。利用EXCEL 計(jì)算桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥PPI 網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)的度中心性（degree centrality，DC）、中介中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）值，以不小于DC（42.63 157 895）、BC（0.012 407 144）、CC（0.715 035 917）平均值為條件，篩選得到PPI 網(wǎng)絡(luò)的核心基因，IL6、TNF、IL1β、CCL2、TP53、IL10、EGFR、FOS、CRP 等。核心靶點(diǎn)蛋白互作PPI 網(wǎng)絡(luò)圖見圖4，提示其可能是桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥的重要作用靶點(diǎn)。

圖3 桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥作用靶點(diǎn)蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥核心靶點(diǎn)蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥作用靶點(diǎn)GO 生物功能富集分析結(jié)果 采用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 生物功能富集分析，共獲得P值小于0.05 的GO功能條目123 條，包括生物過程（biological process，BP）86 條，細(xì)胞組分（cellular component，CC）11 條，分子功能（molecular function，MF）26 條。生物過程主要在炎癥應(yīng)答、RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、脂多糖細(xì)胞的反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的正向調(diào)控、免疫應(yīng)答等方面；細(xì)胞組分主要富集在細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、外側(cè)細(xì)胞膜、細(xì)胞表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等；分子功能主要富集在細(xì)胞因子活性、蛋白作用活性、受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白酪氨酸激酶活性、血紅素結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、生長(zhǎng)因子活性等，見圖5。

圖5 桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥作用靶點(diǎn)GO 分析

2.6 桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥作用靶點(diǎn)KEGG 信號(hào)通路富集分析結(jié)果 通過DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路富集分析，共獲得P 值小于0.05 的KEGG 信號(hào)通路71 條，根據(jù)P值對(duì)前20 條信號(hào)通路繪制氣泡圖，見圖6。前10 位信號(hào)通路富集細(xì)節(jié)，見表4。

圖6 桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥作用靶點(diǎn)KEGG 分析

表4 桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥前10 位信號(hào)通路富集細(xì)節(jié)

3 討論

盆腔炎性疾病后遺癥持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)且難以治愈。盆腔炎的發(fā)生發(fā)展經(jīng)歷了病原體感染、宿主免疫系統(tǒng)激活和抗感染因子釋放3 個(gè)階段[5]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過數(shù)據(jù)可視化分析發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、（+）-兒茶素等成分可能是治療盆底炎性疾病后遺癥的關(guān)鍵藥物成分。通過藥物-疾病作用靶點(diǎn)富集分析結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)的分析，發(fā)現(xiàn)桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因是白細(xì)胞介素6（interleukin6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細(xì)胞介素1-β（interleukin 1-β,IL1β）、趨化因子配體2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）、細(xì)胞腫瘤抗原（Cellular tumor antigen p53，TP53）等。

槲皮素和山萘酚均為黃酮類化合物。大量文獻(xiàn)報(bào)道黃酮類化合物可抑制IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α，從而發(fā)揮抗炎作用。槲皮素的抗炎機(jī)制是抑制炎癥因子的形成[6，7]。山奈酚可以減少炎癥因子的產(chǎn)生，如巨噬細(xì)胞衍生趨化因子（macro phage derived chemokine，MDC）、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（interferon induced protein -10，IP-10）、白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）等，發(fā)揮抑制炎癥的作用[8，9]，從而促進(jìn)人體健康，預(yù)防癌癥、慢性炎癥、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、骨質(zhì)疏松等疾病。β-谷甾醇是一種常見的植物甾醇其抗炎作用是通過抑制表皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中炎癥小體NLRP3 的激活，減少CAS1 的產(chǎn)生及MAPK 信號(hào)通路的活化，最終造成細(xì)胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 生成顯著減少的結(jié)果[10，11]。兒茶素在清除自由基、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路和作用于氧化酶方面發(fā)揮抗氧化作用[12]。趨化因子是具有細(xì)胞招募功能的小分子蛋白質(zhì)。當(dāng)炎癥、損傷和病原體入侵在體內(nèi)發(fā)生時(shí)，趨化因子的表達(dá)增加，免疫細(xì)胞被招募到受損部位，導(dǎo)致身體產(chǎn)生免疫反應(yīng)[13]。通過對(duì)桂枝茯苓丸治療盆腔炎性疾病后遺癥的作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 富集分析，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、腫瘤信號(hào)通路和MAPK 信號(hào)通路是盆腔炎性疾病后遺癥治療的關(guān)鍵通道。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接驗(yàn)證，張新莊等研究了桂枝茯苓膠囊治療痛經(jīng)、子宮肌瘤、盆腔炎的分子機(jī)制，推測(cè)桂枝茯苓膠囊可能通過多種成分作用于多種生物通路，抑制子宮平滑肌增殖、促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管生成和血液循環(huán)、減少雌激素和孕激素的分泌、子宮平滑肌肉收縮和前列腺素等炎癥因子的合成或釋放，從而緩解痛經(jīng)、減輕子宮肌瘤引起的炎癥和疼痛、減少炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步提高患者的生活質(zhì)量[14，15]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，發(fā)掘和闡述桂枝茯苓丸的有效成分及其治療盆腔炎性疾病后遺癥的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的機(jī)制，并初步推斷桂枝茯苓丸可能通過槲皮素、山萘酚、β-谷甾醇、（+）-兒茶素等活性成分作用于IL-6、TNF、IL1β、CCL2、TP53 等關(guān)鍵靶點(diǎn)基因通過抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等作用機(jī)制，最終達(dá)到治療盆腔炎性疾病后遺癥的作用。然而，這項(xiàng)研究還存在一些不足之處，需要后期進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。