結核分枝桿菌TB10.4 蛋白的生物信息學分析

高 燦，趙曉彤，程 江，2

（1.石河子大學醫學院，新疆 石河子 832008；2.石河子大學醫學院第一附屬醫院檢驗科，新疆 石河子 832008）

結核病（TB）是一種由結核分枝桿菌（M.tb）引起的傳染性疾病[1，2]。目前，結核病的感染控制主要靠接種減毒牛分枝桿菌卡介苗（BCG）來實現，但BCG并不能對各個年齡組都起到有效的防護作用[3]。分枝桿菌的耐藥性仍在不斷出現不斷增加，全球健康遭到了耐藥結核菌株的嚴重威脅，將促使開發替代治療方法。Rv0288（esxH）是分枝桿菌蛋白大家族ESAT-6 家族（ESAT6，ESX）的一名成員，編碼分泌蛋白TB10.4 蛋白[4]。研究發現[5]，該基因的表達可以改變INH 和RIF 存在下分枝桿菌的生長，與結核病耐藥性存在潛在關聯。除此之外，TB10.4 蛋白有可能參與鐵/鋅攝取，這一過程在是結核分枝桿菌生長代謝中起重要作用[6，7]。另有研究發現[8]，Rv0288 基因中的編碼蛋白TB10.4 能刺激機體產生細胞免疫，具有一定的免疫原性，使結核病人的免疫系統被識別。因此TB10.4 蛋白有可能成為候選抗原和候選疫苗，用于結核分枝桿菌感染的診斷[9，10]。本研究通過生物信息學技術對結核分枝桿菌TB10.4 蛋白的結構和功能進行預測，以探索TB10.4 蛋白的結核耐藥性機制，尋找其在結核病的藥物新靶點及預防方面的潛在應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 TB10.4 蛋白氨基酸序列來自NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網站。在GenBank 中檢索關鍵詞Rv0288，以獲取H37Rv 全基因組信息。RV0288 基因位于MTB 全基因組的區域，基因ID為 886603；它的編碼蛋白為TB10.4 蛋白（別名Cfp7，Low molecular weight protein antigen 7 EsxH,ESAT-6-Like protein EsxH）,屬于分泌蛋白，在蛋白質庫中的登錄號為CCP43018.1，在UniProt 中的登錄號為P9WNK3。通過NCBI 網站查詢，TB10.4 蛋白由96 個氨基酸序列組成，檢索的氨基酸序列如下：MSQIMYNYPAMLGHAGDMAGYAGTLQSLGAEIAV EQAALQSAWQGDTGITYQAWQAQWNQAMEDLVR AYHAMSSTHEANTMAMMARDTAEAAKWGG。

1.2 方法 使用NCBI 網址中的OFR Finder 軟件分析基因Rv0288 的開放閱讀框架；應用在線軟件ProtParam、ProtScale 對TB10.4 蛋白進行理化性質及親疏水性分析。運用在線軟件SOSUI 及Signal IP 預測TB10.4 蛋白的信號肽和跨膜區，在線軟件TMHMM、NerNGlyc、NetPhos 對TB10.4 蛋白的跨膜結構域、糖基化及磷酸化位點進行預測分析。運用PSORT、WoLF PSORT、CELLO 三個軟件分析TB10.4蛋白的亞細胞定位，在線軟件SOPMA 預測TB10.4蛋白的二級結構，SWISS-MODEL 預測TB10.4 蛋白的三級結構并進行同源建模。運用IEDB 軟件對TB10.4 抗原蛋白的B 細胞表位進行預測蛋白的可塑性、線性表位、表面可及性、親疏水性、β-轉角、抗原性6 個方面并篩選的B 細胞表位；運用SYFPEITHI、RANKPEP 預測TB10.4 蛋白的輔助性T 細胞（Th）表位，SYFPEITHI、RANKPEP、NetMHC預測蛋白的CTL 細胞表位并進行綜合分析；并使用STRING 預測TB10.4 蛋白的相互作用蛋白預測及富集分析。所用軟件具體網址見表1。

表1 使用的基因分析軟件及蛋白預測網站

2 結果

2.1 Rv0288 基因開放閱讀框架 Rv0288 基因（ID：886603）位于MTB 全基因組的351848-352138 區域，全長291 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG，見圖1。

圖1 Rv0288 基因開放閱讀框

2.2 理化性質及親疏水性 TB10.4 蛋白的理論等電點pI 為4.58，相對分子質量為10 390.6；該蛋白由96 個氨基酸組成，含有18 種氨基酸，其中不含吡咯賴氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸，而以丙氨酸（20.8%）、甘氨酸（9.4%）、谷氨酰胺（9.4%）、蘇氨酸（6.2%）4 種氨基酸的比例較高。其中有3 個殘基（Arg+Lys）帶正電荷，9 個殘基（ASP+GLU）帶負電荷。TB10.4 蛋白的分子式為C448H677N125O143S9，原子總數為1402，消光系數為29 450，280 nm 處的吸光度為2.834。當TB10.4蛋白的N 端殘基為Met 時，它在哺乳動物網狀細胞中的半壽期為30 h，在大腸埃希菌體內的半衰期大于10 h。TB10.4 蛋白為非穩定蛋白，其不穩定指數為50.36，脂肪族氨基酸指數為59.38，平均疏水性為-0.266。使用在線軟件ProtScale 分析TB10.4 蛋白為疏水性蛋白，第56 位氨基酸親水性得分最高為-1.744；第30、31 氨基酸疏水性得分最高為0.878，見圖2。

圖2 TB10.4 蛋白的親（疏）水性分析

2.3 信號肽、跨膜區 軟件顯示，TB10.4 蛋白是不含信號肽、沒有跨膜區域的可溶性蛋白；Signal IP 軟件顯示，該蛋白max.C 值為0.121，max.Y 值為0.150，max.S 值為0.263，mean S 值為0.170，其中mean S值＜0.45，預測無信號肽，見圖3。

圖3 TB10.4 蛋白的跨膜結構預測

2.4 糖基化和磷酸化位點 TMHMM 軟件顯示TB10.4 蛋白無跨膜螺旋結構，見圖4；NerNGlyc 軟件顯示該蛋白無糖化位點，見圖5；NetPhos 軟件顯示該蛋白有8 個磷酸化位點，其中磷酸化絲氨酸位點有5 個，分別位于2、27、41、73、74 位氨基酸；磷酸化蘇氨酸位點有2 個，分別位于氨基酸的24 位與88 位；磷酸化酪氨酸位點有1 個，位于氨基酸21位，見圖6。

圖4 TMHMM Server2.0 預測TB10.4 蛋白的跨膜螺旋

圖5 TB10.4 蛋白亞基糖基化位點分析

圖6 TB10.4 蛋白磷酸化位點分析

2.5 亞細胞定位 結果顯示，該蛋白的亞細胞被定位在細胞核內。軟件PSORT 分析cyto-nucl:14，cyto:11，extr:6；軟件WoLF PSORT 分析extr:17，cyto:11，cyto_nucl:8.5，nucl:4；CELLO 分析此種蛋白位于細胞外。故TB10.4 蛋白可能定位于細胞外。

2.6 二級結構及三級結構 運用在線軟件SOPMA 預測TB10.4 蛋白的二級結構，α-螺旋（Hh）83 個，占86.46%；β-轉角（Tt）3 個，占3.12%；β-折疊（Ee）3個，占3.12%；7 個無規則卷曲（Cc），占7.29%，TB10.4 蛋白為不穩定性蛋白，見圖7。

圖7 TB10.4 蛋白二級結構預測

2.7 三級結構同源建模 運用在線軟件SWISSMODEL 軟件預測TB10.4 蛋白的三級結構并進行同源建模，見圖8，SWISS-MODEL 軟件中，運用GMQE和QMEAN 評分進行質量評估。GMQE 評分分數范圍是0～1 分，數字越接近1 分的質量就越高；QMEAN 評分表示預測模型與期望值的一致程度，是基于對蛋白三級結構的不同幾何特性的復合評估，評分范圍為0～4 分，待測蛋白越接近數字0 與模板蛋白就有更高匹配度。三級結構的同源建模，見圖7。該模型的GMQE 評分為0.71，QMEAN 評分為（0.6±0.09）分，與模板2kg7.1.B 氨基酸序列一致性為100%。

圖8 TB10.4 蛋白三級結構預測

2.8 B 細胞表位預測結果 運用IEDB 軟件對TB10.4抗原蛋白的B 細胞表位進行預測，以1.0 作為柔韌性的參數基線。最終篩選出3 個B 細胞表位，見表2。

2.9 TB10.4 蛋白Th 表位、CTL 表位的預測分析結果

2.9.1 Th 表位 運用SYFPEITHI 和RANKPEP 在線軟件，選擇HLA-DR1*0101、HLA-DR1*0401、HLA-DR1*0701 和HLA-DR1*1101 作為HLA 亞型代表，得到5 條共同的強結合Th 抗原表位肽段，見表3。

表3 TB10.4 蛋白輔助性T 細胞表位分析結果

2.9.2 CTL 表位 運用RANKPEP 軟件對TB10.4蛋白進行分析，分值較高的CTL 細胞抗原表位，見表4。CTL 表位分別為QAQWNQAME（55-63）、PAMMLGHAGD（9 -18），運 用 SYFPEITHI、RANKPEP、NetMHC 三種生物信息學軟件對TB10.4 蛋白進行綜合分析，分值較高的CTL 細胞抗原表位，見表5。綜合分析得出的TB10.4 蛋白的CTL 表位數量主要集中分簇于HLA-A2 限制性T細胞表位，少部分位于HLA-A3，無多肽序列分布在HLA-B7 限制性T 細胞表位，推測其最佳候選CTL 表位可能位于IMYNYPAML（4-12）等aa 區段，見表6。

表4 RANKPEP 軟件預測TB10.4 蛋白CTL 表位

表5 不同軟件預測TB10.4 蛋白CTL 表位

表6 TB10.4 蛋白CTL 表位綜合分析

2.10 蛋白相互作用網絡 采用STRING 預測與TB10.4 相互作用的蛋白質，顯示其與等蛋白形成相互作用網絡，有esxS、esxB、esxH、esxG、PPE4、PPE18、PE5、eccD3、eccC3、espG3，見圖9。

圖9 MTB H37Rv 相互作用蛋白

3 討論

結核病作為一種肺部疾病，具有播散性傳播的潛力[11]。一直以來，對結核病的治療由于藥品副作用發生以及患者的依從性差，治療效果往往不佳[12]，多重和廣泛耐藥（MDR 和XDR）結核分枝桿菌（MTB）對全球公共衛生構成了嚴重威脅[2，13]。因此，探索新的分枝桿菌藥物靶點對于在不久的將來有效解決抗結核藥物耐藥性和改善一般結核病控制至關重要[2]。接種BCG 疫苗可預防播散性嚴重的兒童肺結核，但在有效性和持久性上卻有著天壤之別[14]。研究表明[15]，BCG 可能在所有試驗的早期可提供了高水平的保護，但在結核病持續高傳播的環境中，BCG可能提供很少（甚至為零）的長期保護。因此需要一種新疫苗來提供針對兒童和成人結核病的一致和持久的保護性免疫力[16]。ESAT6 由結核分枝桿菌RD1區編碼，是Mt 重要的毒力因子，也被認為是現有的TB 疫苗卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）減毒的重要原因[17]。作為Mtb 分泌的細胞外蛋白，ESAT6 是保護性抗原的重要來源[18]，對巨噬細胞的免疫反應起調節作用，研究報道，ESAT6 能夠誘導巨噬細胞發生凋亡，且ESAT6 融合蛋白對巨噬細胞內的Mtb 生存會產生顯著影響[19]。Rv0288（EsxH）屬于分枝桿菌蛋白大家族ESAT-6 家族（Esx）[20]，大小約為100 個殘基，存在一個保守的中心WXG 基序，是分枝桿菌內協調調節的基因對，編碼分泌蛋白TB10.4 蛋白。

為了較為全面地預測TB10.4 蛋白的結構與功能性質，本研究運用了多種生物信息學軟件對該蛋白進行預測分析。該研究通過生物信息學手段分析TB10.4 蛋白，結果顯示該蛋白理論等電點pI 為4.58，且帶負電荷氨基酸的殘基數多于帶正電荷氨基殘基數，所以TB10.4 蛋白整體帶負電荷，與血漿白蛋白電性相同，提示該蛋白可能是通過入血從而發揮它的作用。TB10.4 蛋白脂肪族氨基酸如丙氨酸（20.8%）、甘氨酸（9.4%）、谷氨酰胺（9.4%）、蘇氨酸（6.2%）在氨基酸組成中所占比例較高，提示該蛋白可能和脂質的運輸相關。TB10.4 蛋白在細胞中半壽期長達30 h，在細菌體內半衰期大于10 h，提示該蛋白可能作為免疫抗原分子在體內發揮持久作用。生物信息學分析顯示TB10.4 蛋白為疏水性蛋白，定位預測該蛋白可能位于細胞外，此外，該蛋白為不含信號肽的非跨膜蛋白，提示該蛋白可能于細胞質基質中合成從而運輸到細胞器中起作用。TB10.4 蛋白有8 個磷酸化位點，提示它可能參與細胞間信號傳導過程。預測結果顯示TB10.4 蛋白二級結構中α-螺旋占86.46%，α-螺旋占比較高的蛋白大多為高度保守蛋白，表明該蛋白可能具有一定的功能。有研究表明，TB10.4 是結核分枝桿菌（Mtb）的一個重要的毒力蛋白抗原[21]，CFP10-TB10.4（CT）融合蛋白與甘露聚糖和洛索里賓的結合物（CT-man-lox）能顯著增強小鼠的CFP10-TB10.4 融合蛋白特異性體液免疫和細胞免疫應答，CT-man-lox 有可能成為一種有效的抗結核分枝桿菌蛋白疫苗[22]。預測分析顯示該蛋白與esxS、esxB、esxH、esxG、PPE4、PPE 18、PE5、eccD3、eccC3、espG3 等多種蛋白相互作用，提示該蛋白參與多種生物學過程。表位預測發現TB10.4 蛋白具有3 條B 細胞表位肽段，分別為QGDTGI、E、AA，同時，該蛋白具有多條與MHC-Ⅱ類分子結合的肽段，但它的具體功能還有待于進行實驗研究進一步驗證。

綜上所述，通過生物信息學技術預測TB10.4 蛋白具有多個B 細胞及T 細胞抗原表位，表明該蛋白可能具有抗原性，提示該蛋白在今后有可能作為抗結核疫苗的候選疫苗。