李利，韓愛萍，田源，劉浩思，鄒天暢，劉孝飛，李振華，徐春明*

（1.北京工商大學 人工智能學院，北京 100048；2.北京工商大學 輕工科學技術學院，北京 100048；3.北京玫瑰日記生物科技有限公司，北京 100024；4.北京有肌時代科技有限公司，北京 100024）

皮膚衰老是多種因素共同作用的結果，這些因素大致可劃分為內部因素和外界環境因素?？旃澴嗟纳?、精神壓力和內耗的增加，導致女性提前衰老的情況越來越多。尤其是女性進入更年期后，因雌激素水平下降，其皮膚老化逐漸明顯。由內延緩皮膚衰老的本質是改變機體內分泌環境，其中雌激素對皮膚的改善作用最為顯著[1]。皮膚衰老機制中，最為廣泛接受的是自由基導致膠原蛋白異常氧化、變性等，致使皺紋增多、皮膚老化[2]。

葛根、人參和雪蓮對于抗氧化、調節內分泌和體內雌激素水平都有一定的功效。葛根是我國傳統的藥食同源植物[3]，含有豐富的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗衰老等作用[4]。《神農本草經》中記載，人參具有補五臟、安精神、益智等功效[5]。雪蓮的使用歷史悠久，具有活血通絡、治療經血不調等功效[6]。但是，葛根-人參-雪蓮抗皮膚衰老的作用機制尚不明確。本研究利用網絡藥理學的方法分析御豐膏中葛根-人參-雪蓮抗皮膚衰老的作用機制，為進一步研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 化合物成分及靶點分析

使用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），檢索葛根、人參、雪蓮化合物成分，設置口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18。檢索UniProt 數據庫，進行靶點標準化。在GeneCards 數據庫中，檢索“estrogen”“antioxidant”“internal secretion”，獲得相關靶點。將結果進行整合，得到葛根-人參-雪蓮潛在作用靶點。

1.2 韋恩圖繪制及靶點蛋白互作（PPI）網絡構建

利用R 語言繪制成分靶點和內分泌、雌激素、抗氧化的相關靶點的交集靶點韋恩圖。使用STRING在線分析平臺，設置置信度＞0.7，預測靶點與靶點之間的相互作用關系。再利用Cytoscape 3.9.1 軟件進行拓撲分析，構建“中藥-成分-靶點”PPI 網絡。

1.3 富集分析

將整理好的靶點蛋白信息用DAVID 數據庫進行富集分析。選擇“Homo sapiens”，將數據導入Excel。用R 語言進行GO 及KEGG 通路富集分析，分析靶點蛋白與通路間關系，并構建“活性成分-靶點-通路”網絡。

1.4 分子對接驗證

對PPI 網絡圖中獲得的核心靶點進行驗證，利用AutoDock Tools 1.5.7 軟件進行分子對接，通過結合能判斷結合情況，利用PyMOL 進行可視化。靶蛋白pdb文件和活性成分分子結構分別來源于PDB 和TCMSP數據庫。

2 結果與分析

2.1 活性成分篩選結果

通過TCMSP 數據庫篩選，共獲得kaempferol（山奈酚）、quercetin（槲皮素）等33 個有效活性成分，其中葛根4 個、人參22 個、天山雪蓮7 個。

2.2 靶點分析及“中藥-活性成分-靶點”網絡圖構建結果

通過GeneCards 數據庫篩選（相關性＞10），并將重復成分和靶點剔除，最終得到21 個活性成分和156 個靶點。如圖1 所示，利用Cytoscape 3.9.1 軟件，根據值（Degree）和介數中心性（Betweenness）繪制網絡互作關系。圖中節點越大，越重要。A1 和B1 分別代表葛根-人參-雪蓮的重復活性成分β-谷甾醇和人參-雪蓮的重復活性成分山奈酚。

圖1 中藥-成分-靶點圖

2.3 韋恩圖繪制及PPI 網絡的建立與分析

如圖2 所示，分別獲得葛根-人參-雪蓮與抗氧化、雌激素和內分泌相關靶點5 個、20 個和75 個。如圖3 所示，運用Cytoscape 3.9.1 繪制網絡圖并明確關鍵靶點。由于與抗氧化作用相關的靶點較少，且HMOX1 核心靶點情況較為明顯，故不進行繪圖展示。最終獲得血管內皮生長因子（VEGFA）、表皮生長因子受體（EGFR）、細胞色素P450 1A1 蛋白（CYP1A1）、血紅素加氧酶1（HMOX1）等關鍵靶點。

圖2 韋恩圖

圖3 PPI 網絡圖

2.4 富集結果分析

利用DAVID 數據庫進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析（P＜0.05），結果如圖4（a）所示。發現葛根-人參-雪蓮的核心靶點是通過影響腺體發育、多肽激素表達及信號釋放等生物過程進行調控。經京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集，篩選出185 條信號通路（P＜0.05），選取占比前20的通路，利用R 語言進行可視化，見圖4（b）。

2.5 活性成分-靶點-通路網絡構建

構建葛根-人參-雪蓮活性成分-靶點-通路圖，如圖5 所示。圓形代表通路，神經活性配體-受體相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）通路發揮著最重要的作用；箭頭代表成分，發揮最主要作用的是木犀草素（XL5）；菱形代表靶點。

圖5 葛根-人參-雪蓮活性成分-靶點-通路圖

2.6 分子對接

選擇“中藥-成分-靶點”網絡中“Degree ＞20”的活性成分，與關鍵靶點VEGFA、EGFR、腫瘤蛋白p53 基因（TP53）、TNF、白介素6（IL6）、CYP1A1、雌激素受體（AR）、HMOX1 進行結合能預測。結果顯示，木犀草素與VEGFA 和TNF 的結合能分別是-19.79 kJ/mol 和-26.65 kJ/mol；山奈酚與TNF的結合能為-25.44 kJ/mol；槲皮素與TNF 的結合能為-24.35 kJ/mol。說明葛根-人參-雪蓮中的活性成分與關鍵靶點有較好的結合性，這也印證了之前的猜測?？梢暬Y果見圖6。

圖6 分子對接模式圖

3 討論與結論

本研究篩選得到33 個葛根-人參-雪蓮有效活性成分，相關交集靶點100 個。富集分析結果顯示，葛根-人參-雪蓮是通過影響腺體發育、多肽激素表達及信號釋放等生物過程對雌激素、內分泌及抗氧化進行調控。并通過調節神經活性配體-受體相互作用、PI3K-Akt 信號通路等起到抗皮膚衰老的作用。有研究發現，槲皮素、木犀草素和山奈酚可直接作用于蛋白激酶B（Akt）[7]，而Akt 可以通過PI3K-Akt 信號通路增加卵巢內血供[8]，增加雌激素分泌，改善皮膚狀態。木犀草素、槲皮素、山奈酚都屬于黃酮類化合物，該類化合物具有抗氧化、抗炎及緩解更年期綜合征等作用[9]，是一類很好的能夠雙向調節機體雌激素水平的化合物[10]。雌激素的穩態對于女性的生理健康及生長發育具有十分重要的作用，對于低雌激素水平的女性人群適當提高雌激素水平，可以調節女性的第二性征的發育，如可以通過刺激胸部的相關受體，達到促進胸部發育的效果。此外，適當補充抗氧化物質能夠增加肌膚彈性，延緩皺紋的產生。

葛根、人參和雪蓮是常見的藥食同源中藥。本研究將三者結合，利用網絡藥理學和分子對接技術，探討了御豐膏中葛根-人參-雪蓮抗皮膚衰老的作用機制。為進一步通過藥食同源方法，改善皮膚狀態，延緩皮膚衰老提供參考。