超聲波輔助復合酶法提取茶樹菇多糖工藝優(yōu)化

李佳虹，趙俊益，杜昕,2*，陳嬡

（1.成都師范學院 化學與生命科學學院，四川成都 611130；2.成都師范學院食品發(fā)酵研究所，四川成都 611130）

茶樹菇（Agrocybe cylindracea）也稱茶薪菇，屬于擔子菌門和田頭菇屬（Agrocybe）。干燥后的茶樹菇可以治療頭痛、嘔吐和老年人哮喘等，對腎虛、癌癥、高血壓有很好的輔助治療功效[1]。茶樹菇多糖具有很強的體外抗氧化特性，是一種超氧自由基捕捉劑[2-3]，同時也可以作為免疫調(diào)節(jié)劑，具有抗腫瘤、降血糖等作用[4]。

傳統(tǒng)的多糖類提取方法有熱水提取法[5]、酸堿提取法[6]等，但均存在耗時長、提取率低、成本高等問題。而超聲波輔助法提取多糖具有效率高、操作簡便快速等優(yōu)點，已被廣泛使用[7]。例如，張君等[8]使用超聲波提取多糖，提取率為16.7%，與熱水浸提法相比，該法的提取率明顯提高。樊偉偉等[9]使用超聲波浸提猴頭菇多糖，提取率為6.22%，是熱水浸提法提取多糖得率的1.45 倍。另外，酶提法液是一種簡單、便捷、綠色無污染的處理方法。謝瑋等[10]利用纖維素酶和果膠酶提取黑松松針多糖，發(fā)現(xiàn)復合酶法優(yōu)于單酶提取法，復合酶法的最大提取率為6.17%。王瑩等[11]同樣使用這兩種酶輔助提取柚子皮多糖，最高提取率為8.26%。與水提醇沉法及纖維素酶輔助法相比，復合酶法的提取效率顯著提高。

為進一步提高多糖提取效率，學者們利用超聲波輔助酶催化水解，并取得了一定成效[12]。廉宜君等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在纖維素酶和果膠酶提取多糖中加上超聲波的輔助，可以使提取效果達到最佳，最大提取率為12.35%。王振西[14]同樣利用該法提取辣木多糖，獲得超聲協(xié)同復合酶的最大提取率為33.03%，比單獨采用超聲法提取多糖的得率高出近2 倍。基于此，本文通過添加纖維素酶和果膠酶，采用超聲輔助復合酶法提取茶樹菇多糖，并通過單因素實驗和響應(yīng)面實驗優(yōu)化茶樹菇多糖提取工藝，以期為茶樹菇多糖在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮茶樹菇，購于溫江大潤發(fā)超市；葡萄糖、硫酸、苯酚、95%乙醇、80%乙醇，分析純，天津市化學試劑有限公司；纖維素酶（100 000 U/g），食品添加劑，寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；果膠酶（酶活力≥500 000 U/g），生化試劑，成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器和設(shè)備

KQ-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；ME204E 電子天平（萬分之一），廣州廣電計量檢測股份有限公司；XL-30C 型超微粉碎機，南京威利朗食品機械有限公司；HWS28 型電熱恒溫水浴鍋，歐萊博科學儀器有限公司；LD5-2B 低速離心機，北京京立離心機有限公司；GM-1.0A 隔膜真空泵，天津津騰實驗設(shè)備有限公司；UV-1100 型紫外可見分光光度計，歐萊博科學儀器有限公司；MIX2000漩渦振蕩器，杭州睿城儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將新鮮茶樹菇置于烘箱中，60 ℃，烘12 h；取干茶樹菇子實體樣品剪碎，粉碎機粉碎，過80 目篩備用。

1.3.2 茶樹菇多糖的提取

參考陳巧玲等[15]的研究方法并進行適當修改。稱取1 g干茶樹菇粉，按一定的料液比加入適量蒸餾水，超聲波（680 W）處理一定時間后，50 ℃水浴0.5 h。稱取一定量的果膠酶和纖維素酶，按酶底比1.5%加入食用菌溶液中，反應(yīng)1 h 后抽濾（微孔過濾膜水系0.45 μm），濾液于沸水中滅酶10 min。用水將上述濾液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，加入50 mL 蒸餾水，裝上磨口的空氣冷凝管，于沸水浴中提取2 h，冷卻至室溫，將溶液轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，加水定容，得到樣品測定液，采用苯酚-硫酸法測定多糖總量。

1.3.3 單因素實驗

選取果膠酶∶纖維素酶質(zhì)量比（1.0 ∶1.0、1.5 ∶1.0、2.0 ∶1.0、2.5 ∶1.0 和3.0 ∶1.0）、超聲時間（20 min、25 min、30 min、35 min 和40 min）、料液比（1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25 和1 ∶30，g ∶mL）3 個因素進行單因素實驗，以多糖提取率為考察指標，探究各因素對茶樹菇多糖提取效果的影響。研究某一因素時，其他因素的控制量為料液比1 ∶20（g ∶mL）、果膠酶和纖維素酶（質(zhì)量比，2.0 ∶1.0）、超聲時間20 min。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面優(yōu)化實驗。使用Design-Expert 軟件進行響應(yīng)面實驗設(shè)計，如表1 所示。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化因素水平表

1.4 多糖含量測定

1.4.1 試劑、溶液配制

苯酚試劑的配制：稱取80 g 苯酚于100 mL 燒杯中，加水溶解，定容至100 mL 后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，置于4 ℃冰箱中避光儲存。吸取5 mL 80%苯酚溶液，溶于75 mL 水中，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

葡萄糖標準溶液（100 mg/L）的配制：稱取0.100 0 g干燥恒重的葡萄糖于100 mL 燒杯中，加水溶解，定容至1 000 mL，于4 ℃冰箱中儲存。

1.4.2 標準曲線繪制

分別吸取0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL的標準葡萄糖工作溶液置于20 mL具塞玻璃試管中，用蒸餾水補至1.0 mL。向試液中加入1.0 mL苯酚溶液，然后快速加入5 mL 硫酸，靜置10 min，使用漩渦振蕩器使反應(yīng)液充分混合，然后將試管置于30 ℃水浴中反應(yīng)20 min，于490 nm 處測定吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。得到的線性回歸方程為y=0.004 9x-0.002 4，R2=0.998 5。

1.5 多糖提取率計算

多糖提取率按公式（1）計算。

式中：c為茶樹菇多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；N為多糖溶液的稀釋倍數(shù)；W為茶樹菇粉末質(zhì)量，g。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，采用Design-Expert 11.0 軟件進行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 復合酶比對茶樹菇多糖提取率的影響

如圖1 所示，隨著果膠酶添加量的增大，多糖提取率呈先增大后減小的趨勢。當復合酶比為1.5∶1.0，多糖提取率達到峰值，酶解催化效率已達最大，隨后提取率逐漸趨于穩(wěn)定。

圖1 復合酶比對多糖提取率的影響

2.1.2 超聲時間對多糖提取率的影響

由圖2 可知，隨著超聲時間的延長，茶樹菇多糖提取率呈先增大后減少的趨勢，當超聲時間為30 min時，茶樹菇的多糖提取率最高。可能是因為超聲波對茶樹菇的細胞膜破壞作用有限，短時間的超聲作用不能使胞內(nèi)物質(zhì)釋放，因此多糖提取率較低。隨著超聲時間的延長，細胞膜被破壞的程度增大，使多糖提取率上升。但當超聲時間超過30 min 時，超聲時間過長，超聲波的機械剪切和熱作用使多糖被破壞與分解，導致多糖提取率減小[16]。由此可得最佳超聲時間為30 min。

2.1.3 料液比對多糖提取效果的影響

由圖3 可知，隨著提取液用量的增大，茶樹菇多糖提取率呈先增大后基本穩(wěn)定的趨勢。當料液比在1 ∶10 到1 ∶25 之間時，隨著提取液用量的增大，多糖提取率大幅增加。在料液比為1 ∶25 時多糖提取率達到峰值，可能是因為多糖在料液比為1 ∶25時已經(jīng)全部溶解出來，而過量加入提取液可能會導致茶樹菇粉在超聲時所吸收的超聲波減少，從而導致多糖溶解不充分。

圖3 料液比對多糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

基于單因素實驗結(jié)果，以復合酶、超聲時間、料液比3 個因素為自變量，以多糖提取率為響應(yīng)值，進行17 次實驗，實驗結(jié)果如表2 所示。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

2.2.2 回歸方程方差分析及顯著性檢驗

為了檢驗回歸方程的有效性以及各種因素對多糖提取率的影響，對數(shù)據(jù)的回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。采用Design-Expert 8 軟件進行回歸擬合，得到擬合回歸方程為Y=24.30+0.061A-0.04B-0.19C-0.015AB+0.098AC-2.5×10-3BC-0.31A2-0.60B2-0.27C2。

表3 實驗結(jié)果方差分析表

從表3 可以看出，模型P＜0.001，失擬項P=0.1771 ＞0.05，影響不顯著。回歸模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.993 2，修正后的相關(guān)系數(shù)R2Adj為0.984 5，說明模型擬合度良好，預(yù)測值與實測值相關(guān)性好，實驗誤差小。因此，本文建立的茶樹菇多糖提取率的回歸模型可用于分析和預(yù)測茶樹菇多糖的提取率。如表3所示，一次項C、交互項AC和二次項A2、B2、C2對多糖提取率影響極顯著，一次項A、B對多糖提取率影響顯著，其他因素的影響不顯著。

2.2.3 響應(yīng)面影響因素的交互作用

由上文可知，AC對多糖提取率的影響顯著，引文本實驗選擇AC進一步進行交互作用分析，料液比與超聲時間的交互作用的響應(yīng)面如圖4 所示。隨著超聲時間和提取液用量的增加，多糖提取率呈先增加后降低的趨勢，并出現(xiàn)了爬坡最高點，結(jié)合底部的二維等高線圖可知，多糖的提取率具有最高點，料液比和超聲時間的交互作用顯著。

圖4 AC 交互作用

2.2.4 最佳工藝參數(shù)確定及驗證性實驗

經(jīng)過模型預(yù)測，多糖的最佳提取條件為料液比為1 ∶29（g ∶mL）、復合酶比為1.5 ∶1.0、超聲時間為29 min，多糖提取率為24.14%。在該條件下進行了3 組平行實驗，實驗結(jié)果見表4。3 組驗證實驗中多糖提取率的平均值為24.128%，與回歸方程所得的預(yù)測值相近，在誤差許可的范圍內(nèi)。此外，該條件下的多糖提取率約為對照組的1.5 倍，說明超聲波輔助復合酶對于茶樹菇多糖率的提取效果顯著。

表4 驗證及對照實驗結(jié)果

3 結(jié)論

本文采用超聲波輔助復合酶法優(yōu)化提取茶樹菇多糖工藝條件，結(jié)果表明最佳提取工藝條件為料液比1 ∶29（g ∶mL）、復合酶比1.5 ∶1.0、超聲波時間29 min，該條件下茶樹菇多糖的提取率為24.128%，約為對照組的1.5 倍，表明超聲波輔助纖維素酶及果膠酶對茶樹菇多糖提取率的影響顯著。本研究結(jié)果可為茶樹菇多糖產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)及參考。