正交法優化廢棄鹵蟲凍干保護劑

李隴梅，閆東科，呂平，李雪，王永苓，郭媛

（1.天津職業大學，天津 300410；2.杰科(天津)生物醫藥有限公司，天津 300467；3.天津海友佳音生物科技股份有限公司，天津 300350）

鹵蟲是一種廣泛分布于日曬鹽場鹽池、沿海灘涂和內陸鹽湖的小型甲殼類嗜鹽濾食動物。鹵蟲無節幼體因營養成分含量高且全面、魚蝦蟹幼苗適口性好、游泳速度慢極易被捕獲等優點，成為各類水產苗種最佳的活體開口餌料。由于養殖水體中的各期鹵蟲幼體及其成體體長較大不適宜作為水產苗種的開口餌料[1]，而且質量不穩定、運輸貯存和加工費用較高，所以各地養殖單位只捕撈鹵蟲滯育卵進行生產銷售。而大量的鹵蟲蟲體廢棄在水中，造成了成千上萬噸的鹵蟲蟲體資源浪費，增養殖水體也遭到了極大污染。鹵蟲富含淡水魚所需的α-亞麻酸（ALA）、海水魚所需的二十碳五烯酸（EPA），且鹵蟲體內二十二碳六烯酸（DHA）含量也非常高。就營養價值而言，中后期鹵蟲幼體及其成蟲的營養價值要高于滯育卵孵化出的用于飼養水產苗種的Ⅰ期無節幼體[2]。因此，開發利用廢棄鹵蟲蟲體資源已迫在眉睫，創新技術手段以解決鹵蟲蟲體資源浪費的產業困境已刻不容緩。

目前，多用真空冷凍干燥制備鹵蟲凍干粉，但其中冷凍和干燥兩個過程均會造成營養成分不同程度的損失，如果對廢棄鹵蟲直接進行冷凍干燥，營養物質只能保留冷凍干燥前的10%～30%，若將蟲體懸浮于適宜的介質中再進行冷凍干燥，營養物質的保存率可超過70%。因此，選擇合適的凍干保護劑非常必要[3]。海藻糖和蔗糖，可通過抑制蛋白質的展開和提供玻璃基質起保護作用[4]；甘露醇被認為是良好的凍干填充劑，應用最廣泛；精氨酸可以與蛋白質形成大約7 個氫鍵，因此精氨酸是過去最常用的氨基酸類冷凍干燥保護劑[5]。

本研究通過單因素實驗研究了海藻糖、甘露醇、蔗糖和精氨酸等4種物質對鹵蟲凍干營養物質保存率的影響；在此基礎上，采用正交實驗對鹵蟲的凍干保護劑組分進行了優化，從而為鹵蟲凍干粉的生產提供了一定的參考依據[6]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

廢棄鹵蟲，杰科（天津）生物醫藥有限公司；KH19A 小型高速離心機，德國Eppendorf 公司；FD-1D-50 真空冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；GC-2030 型氣相色譜儀，配備氫火焰離子化檢測器（FID），日本島津公司；970CRT 熒光分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；海藻糖，食品級，西安木果生物科技有限公司；甘露醇，食品級，江蘇華港生物科技有限公司；蔗糖和精氨酸，食品級，伊諾杰康江蘇肽都科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的處理

將保護劑按比例分別加入到待凍干廢棄鹵蟲溶液中，待保護劑完全溶解后，放置至無菌托盤內備用，每盤100 mL。

1.2.2 凍干處理

將分裝好的樣品放入冷凍干燥機的預凍室，使凍干機的冷阱溫度降至-50 ℃以下。將預凍好的樣品迅速放入凍干機的擱板上并蓋上真空罩，開啟真空泵抽真空，使真空度降至1 Pa，并保持12 h；待樣品完全干燥后，4 ℃保存備用。

1.2.3 單因素實驗

（1）海藻糖質量分數。分別設計海藻糖質量分數為5%、10%、20%、25%，蔗糖、甘露醇、精氨酸質量分數分別為5%、4%、1%，并補充磷酸緩沖液使添加物總量與鹵蟲等重。（2）蔗糖質量分數。分別設計蔗糖質量分數為5%、10%、20%、25%，海藻糖、甘露醇、精氨酸質量分數分別為5%、4%、1%，并補充磷酸緩沖液使添加物總量與鹵蟲等重。（3）甘露醇質量分數。分別設計甘露醇質量分數為4%、8%、12%、16%，海藻糖、蔗糖、精氨酸質量分數分別為5%、5%、1%，并補充磷酸緩沖液使添加物總量與鹵蟲等重。（4）精氨酸質量分數。分別設計精氨酸質量分數為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，海藻糖、蔗糖、甘露醇質量分數分別為5%、5%、4%，并補充磷酸緩沖液使添加物總量與鹵蟲等重。

1.3 測定方法

ω-3 多不飽和脂肪酸的測定依據《DHA、EPA含量測定 氣相色譜法》（GB/T 38095—2019）；維生素C（Vc）含量的測定依據《飼料添加劑 維生素C（L-抗壞血酸）》（GB/T 7303—2018）。

2 結果與分析

2.1 海藻糖單因素分析

凍干樣品DHA、EPA 和VC含量如圖1所示。從圖1中可以看出，隨著海藻糖質量分數的增加，凍干鹵蟲中的DHA、EPA 和VC 含量呈現先升高后降低的趨勢，當海藻糖質量分數達到20%時，各指標含量達到峰值：DHA 含量為2.7 g/kg，EPA 含量為1.2 g/kg，VC含量為28.5 mg/kg。

圖1 海藻糖質量分數對鹵蟲凍干的影響

2.2 蔗糖單因素分析

凍干樣品DHA、EPA 和VC含量如圖2 所示。從圖2 中可以看出，隨著蔗糖質量分數的增加，凍干鹵蟲中的DHA、EPA 和VC含量變化趨勢不一致，當蔗糖質量分數達到10%時，Vc 和EPA 含量達到最大值，分別為28.1 mg/kg 和1.4 g/kg；當蔗糖質量分數達到20%時，DHA 含量達到最大值，為2.8 g/kg。

圖2 蔗糖質量分數對鹵蟲凍干的影響

2.3 甘露醇單因素分析

凍干樣品DHA、EPA 和VC含量如圖3 所示。從圖3 中可以看出，隨著甘露醇質量分數的增加，凍干鹵蟲中的DHA、EPA 和VC含量變化趨勢基本為先升高后降低，當甘露醇質量分數達到8%時，DHA 含量達到最大值為3.3 g/kg；當甘露醇質量分數達到12%時，VC和EPA 含量達到最大值，分別為24.7 mg/kg和1.2 g/kg。

2.4 精氨酸單因素分析

凍干樣品DHA、EPA 和VC含量如圖4 所示。從圖4 中可以看出，隨著精氨酸質量分數的增加，凍干鹵蟲中桿菌的DHA、EPA 和VC 含量變化趨勢為先升高后降低，當精氨酸質量分數達到1.5%時，EPA 含量達到最大值，為1.3 g/kg；當精氨酸質量分數達到2.0%時，DHA 和VC含量達到最大值，分別為3.3 g/kg 和5.4 mg/kg。

圖4 精氨酸質量分數對鹵蟲凍干的影響

2.5 正交實驗

在單因素的基礎上，采用4 因素3 水平試驗設計，對海藻糖質量分數（A）、蔗糖質量分數（B）、甘露醇質量分數（C）、精氨酸質量分數（D）4個因素進行考察，分析篩選出影響較大的因素及最佳凍干保護劑配方，各種保護劑水平設計及結果見表1，其中響應值Y為DHA 含量，Y′為EPA 含量，Y′′為維生素C含量。

表1 正交實驗設計及結果

由表1極差R、R′、R′′分析可知，4 種保護劑對凍干的DHA、EPA、維生素C 含量的影響作用是一致的，其中海藻糖質量分數對營養質量分數對營養成分的影響最大。根據極差分析，含量最高組的最佳組合為A2B2C1D3，因為這個組合不在已做的9次試驗中，所以對A2B2C1D3進行了單獨驗證，發現凍干鹵蟲的三種營養成分的保存率為90%以上，均高于表1中的含量，所以最佳組合為A2B2C1D3，即最佳凍干保護劑配方為20%海藻糖+15%蔗糖+8%甘露醇+2%精氨酸。加入該保護劑后，鹵蟲中DHA、EPA、VC 的含量分別為4.8 g/kg、2.2 g/kg、38.3 mg/kg。

3 結論

廢棄鹵蟲的最佳保護劑配方為20%海藻糖+15%蔗糖+8%甘露醇+2%精氨酸。加入凍干保護劑后，檢測二十二碳六烯酸（DHA）為4.8 g/kg，二十碳五烯酸（EPA）為2.2 g/kg，維生素C 含量為38.3 mg/kg。