蘇云金芽孢桿菌BT 蛋白動物安全性試驗

劉鼎闊，董惠峰，寧未萌，劉闊，劉芳，李源，胡鵬程*

（1.鼎正新興生物技術（天津）有限公司，天津 300383；2.天津農學院，天津 300393；3.天津市生物飼料添加劑企業重點實驗室，天津 300383；4.天津市飼用小分子蛋白工程中心，天津 300383）

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在營養生長階段會產生外泌型的VIP 蛋白，進入出芽生殖期后在芽孢內會伴生一種特殊的伴孢晶體CRY 蛋白，這些蛋白均具有殺蟲效果，統稱BT 蛋白[1]。BT 蛋白的殺蟲機制已經得到廣泛研究，基本途徑為蟲體的中腸上皮細胞存在特異位點，可以在與BT 蛋白結合后引起膜穿孔，最終導致蟲體死亡[2-4]。該機制主要作用于鱗翅目昆蟲，因哺乳動物的腸細胞表層不含BT 蛋白受體，所以人和家畜動物對這種蛋白不敏感，因此BT 蛋白作為一種無害殺蟲劑在殺蟲領域得到廣泛應用[5-6]。但是BT 蛋白的毒理作用是否會因為其在體內積累而引起哺乳動物的病變目前尚無確定結論，所以本文旨在通過加大蘇云金芽孢桿菌濃度，選擇健康小鼠為靶動物，了解BT 蛋白純化液對動物的臨床表現、生理生化指標的影響，為該產品在臨床上的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雌性健康小鼠40 只（實驗動物許可證：SYXK(京)2020-0053），體重18 ～22 g；蘇云金發酵BT 蛋白純化液，鼎正新興生物技術（天津）有限公司；蛋白胨、酵母粉，天津市北聯精細化學品開發有限公司。

SHY-2A 恒溫水浴搖床，上海比郎儀器制造有限公司；H1850R 低溫離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Countess 3 血球計數儀，賽默飛世爾科技公司；FDC NX500iVC 血生化儀，富士膠片醫療系統有限公司；HS-3315 組織切片機，北京萊博瑞杰科技有限公司；ECLIPSE SI 顯微鏡，尼康精機（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組

將試驗小鼠隨機分為4 組，每組10 只，分組情況見表1。

表1 試驗動物分組與處置

1.2.2觀察指標

一般動物安全性實驗觀察周期在7 ～28 d，本實驗考慮發酵制品儲存周期不宜過久，且儲存期越長，污染風險越高；另考慮BT 蛋白在胃腸環境極易吸收，7 d足以產生足夠的積累，所以確定第7 d 觀察相關指標。

1.2.2.1臨床觀察

試驗期間每日觀察受試動物是否出現與藥物相關的不良反應，如呼吸與行為異常、精神抑制及排糞異常等情況。

1.2.2.2體重

對試驗前及試驗結束后受試小鼠稱量體重，做好記錄。

1.2.2.3血樣分析

（1）采血及處理方法。所有動物分別在給藥前和給藥結束后采血，分兩管放置；其中1 管為帶抗凝劑的離心管，用于血常規分析；另一管不帶抗凝劑，血液樣品于室溫下靜置2 h，2 500 r/min 離心5 min，取上層血清，-20 ℃保存，用于血液生化指標分析。

（2）血常規分析。取加抗凝劑管全血進行白細胞計數（WBC）、白細胞分類[嗜中性粒細胞（NE）、淋巴細胞（LY）、單核細胞（MO）、嗜酸性粒細胞（EO）、嗜堿性粒細胞（BA）]、紅細胞計數（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細胞壓積（HCT）、血小板計數（PLT）等指標分析。

（3）血液生化指標分析。取血清進行丙氨酸氨基轉換酶（ALT）、天門冬氨酸轉換酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）、總膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）等指標分析。

1.2.2.4解剖學檢查

對靶動物進行大體解剖學檢查，對心、肝、脾、肺、腎等臟器有選擇地做病理學剖檢和病變組織觀察，了解該制劑臨床應用的安全性。

1.3 統計分析

數據以均值±標準差格式展示，采用SPSS 13.0中卡方檢驗分析組間差異，P＜0.05 和P＜0.01 分別表示差異顯著和極顯著。

2 結果與分析

2.1 給藥后臨床觀察

各組動物給藥后的呼吸、行為、精神、排糞、食欲等均正常，未出現不良反應。

2.2 給藥前后體重變化

給藥前和給藥后動物體重結果見表2。結果表明，給藥前后各組小鼠的體重差異不顯著（P＞0.05）。

表2 給藥前和給藥后小鼠體重變化（單位：g）

2.3 血常規分析結果

各組小鼠的血常規指標檢測結果見表3。從表3中可以看出，各劑量組給藥前后的血常規指標與正常組比較差異不顯著（P＞0.05），說明Bt 發酵純化上清液在0.2 mL/kg、0.6 mL/kg、1.0 mL/kg 劑量范圍對血液常規指標沒有明顯的影響。

表3 不同劑量Bt 發酵純化上清液對小鼠血常規指標的影響

2.4 血液生化分析結果

小鼠的血液生化指標檢測結果見表4。從表4 中可以看出，各劑量組給藥前后的血液生化指標與正常組比較差異不顯著（P＞0.05），說明Bt 發酵純化上清液在0.2 mL/kg、0.6 mL/kg、1.0 mL/kg 劑量范圍對血液生化指標沒有明顯的影響。

表4 不同劑量Bt 發酵純化上清液對小鼠血液生化指標的影響

2.5 尸體解剖及組織觀察結果

1.0 mL/kg 劑量組和對照組的心、肝、脾、肺、腎的組織切片見圖1。大體剖檢結果和組織學檢查均無明顯的肉眼可見病理變化。

圖1 組織切片

3 結論

綜上所述，Bt 發酵純化上清液按0.2 mL/kg、0.6 mL/kg、1.0 mL/kg 劑量給藥，小鼠體態特征與對照組相比未見異常；血常規、血液生化分析等檢測結果顯示兩組差異不顯著；給藥結束后解剖小鼠，制作組織切片，通過10 倍和40 倍顯微鏡觀測仍未見病理變化。由此說明，Bt 發酵純化上清液的生物安全性極高。