魏寶紅，劉佳，畢旺華，胡淑曼，馬曉青，楊文哲，楊雪*，孫皓巖，張鵬

（1.中國海洋大學 醫藥學院，山東青島 266003；2.青島海洋生物醫藥研究院，山東青島 266071）

桑黃（Inonotus hispidus）屬真菌界、擔子菌門、傘菌綱、銹革孔菌目、銹革孔菌科，是一種多年生的珍稀食藥兼性菌類，屬于高附加值食用菌，有“森林黃金”之美稱，是目前國際公認的生物治癌領域中有效率排在第一位的藥用菌[1-4]。《神農本草經》《藥性論》和《本草綱目》等記載，桑黃利五臟，宣腸胃氣，排毒氣。桑黃的主要活性成分為多糖、黃酮及三萜類物質，具有很好的抗腫瘤、降血糖、降血脂和活血化瘀等功效[5-10]。

桑黃菌屬于多基原真菌，目前我國桑黃類真菌主要包括桑黃菌屬的桑樹桑黃菌（Sanghuangporus sanghuang）、鮑姆桑黃菌（S. baumii）、瓦寧桑黃菌（S. vaninii）和纖孔菌屬的粗毛纖孔菌（Ionnouts hispidus）等[11-12]。野生桑黃在我國主要分布在東北、西藏南部及東南部，云南、四川、湖南、湖北、陜西山區也有少量分布，國外主要分布在日本、韓國、俄羅斯等地。野生桑黃在中國經過多年的采收后，產量逐年減少，較大型的子實體需要10 年以上長成[13]。由于其自身這種生理狀態的特殊性、復雜性及外界環境的影響，野生桑黃菌子實體稀少，且人工栽培周期長，其產量已無法滿足人們對珍稀桑黃日益增長的需求，使得桑黃子實體的開發和利用受到了限制，因此探究桑黃液體發酵菌絲體替代子實體的應用極具開發意義。液體發酵技術具有生產周期短、工藝簡單、效率高等優點，可有效解決桑黃資源短缺問題。

本研究以菌絲體生物量、胞內多糖含量、胞內黃酮含量、DPPH 清除率等為考察指標，通過單因素試驗和正交試驗確定最優液體發酵培養基，并進行擴大培養，研究桑黃菌絲體在放大生產過程中菌絲體質量、胞內成分的變化規律。同時，對擴大培養獲得菌絲的生物活性進行初步評價，以期為工業生產過程中桑黃發酵產物的精準把控提供依據，為桑黃菌絲體的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

MDQ-B1T 振蕩培養箱，上海旻泉儀器有限公司；ZHJH-C1115B 垂直流超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；LDZH-150KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；ME204E 萬分之一天平，梅特勒-托里斯多儀器（上海）有限公司；GL 冷凍高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；UV6000PC 紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；HWS-26 水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；30 L 自動滅菌發酵罐，上海百侖生物科技有限公司。

1.2 材料與試劑

實驗用菌種由臨清清源正本生物醫藥科技有限公司提供；人非小細胞肺癌細胞A549、人結腸癌細胞HCT-116、人肝癌細胞HepG2、人乳腺癌細胞MCF-7、人宮頸癌細胞Hela、人臍靜脈內皮細胞HUVEC，中科院上海細胞庫；安琪酵母浸粉FM902（2022051401B1），安琪酵母股份有限公司；麥芽糖（2020210416），國藥集團化學試劑有限公司；馬鈴薯淀粉（食品級），上海楓未食業有限公司；蛋白胨（BR，20190520），北京雙玄微生物培養基制品廠；玉米面粉（食品級），嘉祥永勝食品有限公司；可溶性淀粉、尿素、蔗糖、乳糖、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化銨、硫酸銅、硫酸鋅及亞硫酸鐵等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。PBS 磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.2 ～7.4，批號為2022102403）、RPMI1640 培養液（貨號CR31800，批號2022101103）、DMEM 高糖培養液（貨號CR12800，批號2022112502）、McCOY’S 5A（貨號CR16600，批號2022032202），均購自浙江森瑞生物科技有限公司；鹽酸阿霉素（703E021），北京索萊寶科技有限公司；青鏈霉素混合液（20221012），北京索萊寶科技有限公司；Tris（161-0716），美國BIO-RAD 公司；SRB（MKBG5106V），北京索萊寶科技有限公司；96 孔細胞培養板、90 mm×20 mm 細胞培養皿，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養基配方

（1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g/L（煮汁），葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L。

（2）液體種子培養基：去皮馬鈴薯200 g/L（煮汁），葡萄糖20 g/L。

（3）基礎培養基：葡萄糖20 g/L、酵母浸粉5 g/L、KH2PO46 g/L、MgSO43 g/L。

1.3.2 菌種活化

接種桑黃菌種于PDA 固體培養基，于28 ℃恒溫培養箱培養10 d。

1.3.3 液體種子培養

將活化后的菌種用接種環取同樣大小的菌塊（0.5 cm×0.5 cm），每瓶接種5 個菌塊，每個500 mL培養瓶的裝液量為200 mL，于28 ℃、160 r/min 振蕩培養10 d。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 試驗設計

（1）碳源篩選試驗：在基礎培養基配方中，分別以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖、馬鈴薯淀粉為碳源，添加量為20 g/L，接種量為10%，裝液量40%，于28 ℃、160 r/min 培養7 d，每組設定3 個重復，測定菌絲體質量、胞內多糖產量、胞內黃酮產量。

（2）氮源篩選試驗：在基礎培養基配方中，分別以麩皮、玉米粉、酵母浸粉、蛋白胨、氯化銨、尿素為氮源，添加量為5 g/L，其他試驗條件及考察指標同1.3.4.1 項（1）。

（3）無機鹽種類篩選：在基礎培養基配方中，分別 添 加1 g/L MnSO4、ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CuSO4和Na2SO4，以不加上述無機鹽為對照，其他試驗條件及考察指標同1.3.4.1 項（1）。

（4）碳源添加量考察：在確定了最優碳源、氮源、無機鹽種類后，碳源添加量設定為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%，保持其他培養基組成比例不變[同1.3.1（3）]，試驗條件及考察指標同1.3.4.1項（1）。

（5）氮源添加量考察：在確定了最優碳源、氮源、無機鹽種類后，將氮源添加量設定為0.25%、0.50%、1.00%、2.00%、4.00%，其他培養基組成比例不變[同1.3.1（3）]。其他試驗條件及考察指標同1.3.4.1 項（1）。

（6）無機鹽添加量考察：有文獻報道，藥用真菌桑黃液體發酵培養基優化中，無機鹽的添加量范圍較窄，通常最優比例在0.1%～0.2%[14-15]，本文在確定了無機鹽種類的基礎上選取無機鹽添加量為0.05%～0.20%，并進行下一步正交試驗考察。

1.3.4.2 試驗評價方法

以菌絲體生物量、單位質量菌絲體中總糖含量、單位質量菌絲體中總黃酮含量為主要評價指標，進行單因素試驗考察，并計算綜合得分。綜合得分按公式（1）計算。

式中：MB、TS、TF分別代表實驗中測定樣品的菌絲體生物量、單位質量菌絲體總糖含量、單位質量菌絲體總黃酮含量；MBmax、TSmax、TFmax分別代表實驗中測定樣品的菌絲體生物量、單位質量菌絲體總糖含量、單位質量菌絲體總黃酮含量的最大值。

1.3.5 正交試驗

1.3.5.1 試驗設計

以單因素試驗為基礎，選用L9(34)正交表進行試驗，每個因素設定3 個水平，因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.5.2 評價方法

試驗條件及考察指標同1.3.4.1 項（1），以菌絲體質量、單位質量菌絲體中總糖含量、單位質量菌絲體中總黃酮含量及DPPH 清除率等指標的綜合評分進行評價。綜合評分按公式（2）計算。

式中：MB、TS、TF、DC分別代表實驗中測定樣品的菌絲體生物量、單位質量菌絲體總糖含量、單位質量菌絲體總黃酮含量和DPPH 清除率；MBmax、TSmax、TFmax、DCmax分別代表實驗中測定樣品的菌絲體生物量、單位質量菌絲體總糖含量、單位質量菌絲體總黃酮含量和DPPH 清除率的最大值。

1.3.5.3 最優工藝驗證試驗

按照優化后的發酵工藝進行驗證，設定3個重復，結果取平均值。

1.3.6 擴大培養

采用試驗優化后的培養基進行30 L 發酵罐的擴大培養，初步探索放大工藝。在30 L 發酵罐中加18.0 L 液體培養基，閉罐，于115 ℃滅菌1 h 后用冷卻水循環冷卻。取500 mL 錐形瓶培養10 d 的桑黃菌絲體10 瓶，在無菌操作下倒入發酵罐中，接種量為10%，設定溫度為28 ℃，攪拌漿轉速為300 r/min，罐內氣壓為0.02 ～0.04 MPa，培養9 d，觀察記錄。

1.3.7 指標測定

（1）菌絲體生物量的測定：將發酵液收集后用紗絹過濾，將紗絹上的菌絲體用無菌水淋洗2 次后，每次取200 mL，10 000 r/min 離心10 min，取沉淀于60 ℃烘箱中烘干，稱重得菌絲體產量。

（2）菌絲體中總糖含量測定：將菌絲體烘干后研磨，采用熱水浸提法進行提取，具體方法為料液比1 ∶20（g ∶mL），提取溫度60 ℃，提取時間2.5 h，12 000 r/min 離心10 min，取上清，提取2 次，合并上清液，備用[16-18]。以葡萄糖為標準品，采用蒽酮-硫酸法測定菌絲體總糖含量[19-21]。

（3）菌絲體中總黃酮含量測定：將菌絲體烘干后研磨，取0.2 g 加2 mL 70%乙醇，在70 ℃下超聲提取兩次，每次0.5 h，12 000 r/min 離心10 min，取上清，提取2 次，合并上清液，備用[22-25]。以蘆丁為標準品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定黃酮含量[25-26]。

1.3.8 抗氧化活性測定

以維生素C 為陽性對照，按照CHEN 等[27]的方法測定DPPH 自由基清除活性，清除率按公式（3）計算。

式中：A1表示樣品在517 nm 處的吸光度；A2表示以70%乙醇代替樣品測定的吸光度；A0表示以70%乙醇代替DPPH 溶液測定的吸光度。

1.3.9 抗腫瘤活性測定

采用SRB 法測定桑黃菌絲體對6 種細胞的增殖抑制能力。取對數生長期的A549、HCT-116、HepG2、MCF-7、Hela、HUVEC 細胞分別以5 000個/孔接種于96 孔板，四周加入100 μL PBS 防止邊緣效應。將96 孔板放入培養箱中培養，待細胞貼壁。將之前培養的96 孔板取出，棄去培養基，加入不同種類的含藥培養基。設置樣品組、陰性對照組和陽性對照組。其中，樣品組分別為正交驗證試驗樣品（S1）、擴大培養第5 天的樣品（S2），終濃度均為100 μg/mL；陽性對照組藥物為阿霉素，終濃度為1 μmol/L；陰性對照組加入同樣品組相同體積的無菌水，每個樣品設3 個復孔。藥物作用72 h 后，每孔加入50%（m/v）冰冷的三氯乙酸（TCA）固定細胞，SRB 染色后，加入Tris 溶液，于酶標儀上測定540 nm處的OD 值，按公式（4）計算受試樣品對腫瘤細胞生長的抑制率。

式中，ODck和ODeg分別為540 nm 下對照組和給藥組的OD值。

1.4 數據統計及分析

每組試驗平行測定3 次，結果以±s表示。檢測結果采用Excel 2021軟件作圖，SPSS 21.0軟件分析，采用t-test 統計分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 種類篩選結果

由圖1 可以看出，碳源、氮源、無機鹽的種類對桑黃液體發酵影響較大。當培養基中的碳源為蔗糖時，綜合評分最高，因此本研究選擇蔗糖作為碳源；當選擇酵母浸粉、麩皮與蛋白胨為氮源時，評分較高且無顯著性差異，綜合考慮，選擇酵母浸粉作為氮源；無機鹽的選擇中，硫酸銅可以明顯促進桑黃液體發酵各評價指標的提高。因此，確定培養基的碳源、氮源、無機鹽種類分別為蔗糖、酵母浸粉和硫酸銅。

圖1 不同碳源、氮源、無機鹽種類對桑黃發酵結果的影響

2.1.2 添加量篩選結果

如圖2 所示，蔗糖添加量在1%～4%時，評分基本一致，因此本文選擇蔗糖添加量為1%～3%進行后續正交試驗；酵母浸粉的添加量考察中，未獲得明顯的平臺期，提示后期的正交試驗需繼續提高酵母浸粉的添加量，本文設置酵母浸粉添加量為2%～6%進行后續正交試驗。

圖2 碳源、氮源添加量對桑黃發酵指標的影響

2.2 正交試驗結果

正交試驗結果及方差分析見表2、表3。由R值可知，影響桑黃發酵程度的因素為B ＞C ＞A，K值分析可知最佳培養基配方為A3B1C2，即蔗糖3%、酵母浸粉2%、硫酸銅0.1%，但該配方組合與正交表中最優組合不一致，因此進行進一步的驗證。驗證試驗結果顯示，A3B1C2組合的綜合評分均值為0.93 分，相對誤差較小，試驗結果穩定，可為以液態發酵法大量生產菌絲體提供理論支持，因此確定最佳組合為A3B1C2。

表2 正交試驗結果表

表3 正交實驗結果的方差分析

2.3 擴大培養實驗結果

為了逐步將桑黃的發酵工藝應用于實踐中，將搖瓶的發酵條件進行30 L 的擴大培養，從第5 天起，每隔24 h 取樣，共培養9 d，測定菌絲體生物量、菌絲體的總糖含量、總黃酮含量及DPPH 清除率。由表4 可知，本次擴大培養第5 天樣品的綜合評分最高（0.90分），發酵菌絲體生物量為9.74 g/L（第5 天），較正交驗證試驗所得菌絲體生物量提高了41.36%，而單位質量菌絲體中總糖含量、單位質量菌絲體中總黃酮含量及DPPH 清除率呈現不同程度的下降。結合兩種培養規格下菌絲的生長狀態（搖瓶中主要是菌絲球，而發酵罐中主要是菌絲），推測原因可能是擴大培養時，發酵罐中攪拌槳的轉速為300 r/min，明顯高于搖瓶轉速（160 r/min），較高的轉速增加了溶氧量，促進菌絲體生物量的大幅提升；但較高轉速容易導致菌絲無法生長成球，且細胞壁破壞程度高，菌絲的胞內成分大量溶出至發酵液中，從而導致菌絲體中各成分含量的減少。

表4 擴大培養實驗結果表（±s）

表4 擴大培養實驗結果表（±s）

樣品來源 樣品名稱 培養時間/d 指標 綜合評分/分生物量/（g/L） 總糖含量/（mg/g） 總黃酮含量/（mg/g） DPPH 清除率/%正交驗證 S1 7 6.89±0.22 120.30±3.21 4.90±0.08 75.07±2.21 0.93±0.02擴大培養S2 5 9.74±0.28 68.84±1.22 2.56±0.07 28.95±0.82 0.90±0.02 S3 6 10.18±0.33 59.62±1.32 2.10±0.03 28.74±0.78 0.80±0.02 S4 7 10.78±0.35 52.57±1.11 2.10±0.03 30.69±0.75 0.81±0.01 S5 8 11.39±0.32 54.70±1.20 2.40±0.05 26.32±0.62 0.77±0.02 S6 9 14.39±0.25 40.14±1.08 1.98±0.03 25.11±0.55 0.71±0.01

2.4 桑黃菌絲體體外抗腫瘤活性

結合表4 可知，擴大培養第5 天樣品的綜合評分最高（0.90 分），因此選取第5 d 的樣品進行體外抗腫瘤活性評價。對正交驗證樣品S1 和擴大培養樣品S2的體外抗腫瘤活性進行測定，結果見表5。2 個樣品對HCT-116、Hela、HUVEC、HepG2 均表現出不同程度的抑制作用，其中對HUVEC 細胞的增殖抑制作用最強，且S2 活性明顯高于S1；2 個樣品對A549、MCF-7 細胞的增殖未表現出抑制作用。

表5 2 種桑黃水提物對6 種人源腫瘤細胞的體外抑制率（±s，%）

表5 2 種桑黃水提物對6 種人源腫瘤細胞的體外抑制率（±s，%）

組別 HUVEC HepG2 Hela HCT-116 A549 MCF-7 S1 36.59±3.79 17.19±1.90 19.12±0.45 19.00±1.92 3.92±2.90 -11.03±5.70 S2 45.31±0.06 39.67±2.28 18.88±4.51 14.74±1.93 2.73±2.37 2.34±0.05阿霉素 93.59±0.01 92.02±0.54 88.31±4.51 94.01±0.61 92.21±0.3 71.13±2.43

3 討論與結論

藥用真菌發酵方式包括固體發酵和液體發酵。其中，固態發酵即人工栽培技術，在藥用真菌的生產中有一定的應用，但是由于藥用真菌生理需求的特殊性和復雜性，人工栽培藥用真菌技術存在周期長、能耗高、產率低等問題，嚴重制約了藥用真菌的開發利用。利用液體發酵技術獲取菌絲體代替子實體是目前的研究熱點。液體發酵培養具有菌絲體產量高、培養周期短、可控性好等優點，更易于工業化大量生產，具有廣泛的市場前景。在液體發酵中，菌絲體的生長及有效成分的積累不僅與碳源、氮源、無機鹽的種類密切相關，而且受碳氮源、無機鹽比例及濃度的影響。本研究通過單因素和正交試驗，篩選出適用于桑黃液態發酵的最佳工藝，同時進行放大培養，并對其菌絲體抗腫瘤活性進行了初步探索。研究確定了桑黃液體發酵培養基配方為蔗糖3%、酵母浸粉2%、硫酸銅0.1%、磷酸二氫鉀0.6%、硫酸鎂0.3%，優化得到的培養工藝條件穩定、重復性良好，成本較低，適合放大生產。抗腫瘤活性研究結果顯示，液體發酵菌絲體水提物對HUVEC、HepG2 有較強的增殖抑制作用。

本研究中30 L 發酵罐的擴大培養為桑黃液態發酵的擴大生產和應用奠定了堅實基礎，對桑黃的優質高產具有重要的指導意義，可有效解決其資源匱乏的問題。后續將對液態發酵菌絲體與子實體在成分、功效方面的差異進行對比研究，以期推動桑黃在食藥用菌產業方面的推廣和應用。