熒光PCR 技術在麝香壯骨膏控制菌檢查中的應用

李宏鐸，李亞楠，沙 淼，夏 天，崔 迎，楊曉莉

（1.西安市食品藥品檢驗所，陜西 西安 710054；2.國家藥品監督管理局藥品微生物檢測技術重點實驗室，陜西 西安 710065；3.陜西省食品藥品檢驗研究院，陜西 西安 710065）

2020 年版《中國藥典》 四部0122 貼膏劑規定貼膏劑包括凝膠貼膏（原巴布膏劑或凝膠膏劑） 和橡膠貼膏（原橡膠膏劑）［1］。2005 年版《中國藥典》 二部微生物限度檢查法引入驗證理念，使得檢測結果更科學準確［2］。在微生物限度檢查項下規定，凝膠貼膏和橡膠貼膏的控制菌為每10 cm2不得檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus） 在自然界中廣泛存在，30%～80% 的人為該病原菌的攜帶者［3］，約32%的食品中含有該菌［4］，金黃色葡萄球菌也是最常見的化膿性感染致病菌［5］。而銅綠假單胞菌 （Pseudomonas aeruginosa） 為條件致病菌，可引起傷口、呼吸道、泌尿道的感染［6-7］。目前藥品微生物檢查的生化方法，操作繁瑣，時間長［8］，需要建立更加準確、快速的檢測方法。

藥品控制菌檢驗的技術有實時熒光PCR 技術、變性梯度凝膠電泳、隨機引物擴增多態性技術、基因芯片技術、核酸分子雜交技術等［9-10］。實時熒光PCR 靈敏度高，特異性好，是目前微生物檢驗重要手段［11］。多重熒光PCR 通過使用多對引物、探針，能同時對多個目標序列檢測，結果更快速、準確［12］。劉婷婷等［13］建立了實時熒光PCR 技術檢驗金黃色葡萄球菌。申應德等［14］建立了藥品中沙門菌熒光PCR 方法。柯振華等［15］建立了金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌的多重PCR 方法。張靜等［16］提出了食源有害微生物DNA 快速提取與多重PCR 檢測初探。胡興娟等［17］進行了四重熒光定量PCR 法對腸炎、鼠傷寒以及傷寒沙門氏菌的鑒定。

1 材料

1.1 儀器與試劑 LC480 熒光定量PCR 儀（瑞士羅氏公司）；5430R 高速冷凍離心機、Biospectrometer 紫外／可見光／熒光分光光度計（德國艾本德公司）。細菌基因組DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京） 有限公司］；熒光定量PCR 反應試劑盒（日本TaKaRa 公司）；胰酪大豆胨瓊脂培養基（北京三藥科技開發公司）。水為超純水。

1.2 菌株 見表1。

表1 菌株樣品信息

1.3 引物及探針 參考文獻［18］ 報道，金黃色葡萄球菌根據femB基因序列，銅綠假單胞菌根據ETA基因序列設計引物及探針，見表2。

表2 引物與TaqMan 探針

1.4 藥物 本實驗樣品為2021 年國家藥品評價性抽驗品種麝香壯骨膏，共計全國40 個生產廠家，260 批。按照2020 年版《中國藥典》 四部檢查控制菌后，均為未檢出，作為陰性樣品。

2 方法

2.1 細菌培養及模板DNA 的提取 分別吸取1 mL 菌株的純培養液，細菌基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，Biospectrometer 紫外／可見光／熒光分光光度計測定核酸濃度。建立DNA 模板庫，保存于-20 ℃備用。

2.2 熒光定量PCR 檢測方法 雙重熒光定量PCR 反應體系為25 μL，體系組成為10×Probe qPCR mix 12.5 μL，正向、反向引物（10 mol／L） 各1 μL，探針0.5 μL，模板DNA 2 μL，加水至25 μL。實時熒光定量PCR 儀反應參數為95 ℃預變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火并延伸45 s，共40 個循環，在每個循環的60 ℃退火并在延伸階段收集熒光信號。設立培養基提取陰性對照，無菌水為空白對照。

2.3 靈敏度 按“2.2” 項下反應體系對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌進行雙重熒光PCR 反應，將DNA 模板10倍系列稀釋，同時用胰酪大豆胨瓊脂培養基對其進行菌落計數。選取10-1～10-6DNA 濃度，其對應的初始菌濃度對數值與Ct 值作標準曲線。

2.4 特異性 按“2.2” 項下反應體系將24 株菌的DNA同時添加為模板，進行雙重熒光定量PCR 反應。此24 種菌為日常藥品檢測中常見菌種、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、球菌、桿菌的典型代表，同時加入模板可以范圍更廣的證明所用引物特異性的優劣。

2.5 重復性 選取不同濃度金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌DNA 模板混合后，進行3 次PCR 分析，比較重復性。

2.6 控制菌檢查方法 取供試品100 cm2，加5 mL 聚山梨酯80，再加pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，靜置，取水相為1 ∶10 的供試液，分別取10 mL 供試液接種至胰酪大豆胨液體培養基中混勻，一份按照《中國藥典》 規定方法進行檢驗，另一份將菌液濃度為10 cfu／mL 金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌加入到培養基中，35 ℃培養24 h，取增菌液1 mL，按細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA 作模板，進行熒光定量PCR 檢測。

3 結果

3.1 靈敏度試驗結果 金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌基因組DNA 梯度稀釋至10-6。金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌最低檢測限分別為20、10 cfu／mL，結果見圖1～2。以DNA 稀釋倍數為橫坐標（X），Ct 值為縱坐標（Y） 進行回歸，得到金黃色葡萄球菌方程為Y＝3.536X+13.77 （R2＝0.998 7），銅綠假單胞菌方程為Y＝3.325X+15.68 （R2＝0.997 2）。表明Ct 值與DNA 濃度的對數值的線性關系良好，檢測體系準確可靠。

圖1 金黃色葡萄球菌靈敏度試驗結果

圖2 銅綠假單胞菌靈敏度試驗結果

3.2 特異性試驗結果 雙重熒光定量PCR 反應對24 株菌株的結果見圖3～4。金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌Ct 值分別為16、17，其他菌株均為陰性反應。表明對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的雙重熒光PCR 反應特應性好，能夠同時用來檢測貼膏劑中的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌這2 種控制菌。

圖3 金黃色葡萄球菌特異性試驗結果

圖4 銅綠假單胞菌特異性試驗結果

3.3 重復性試驗結果 相同濃度每次擴增曲線基本吻合。金黃色葡萄球菌的Ct 值分別為15.43、15.36、15.39，變異系數為0.19%，銅綠假單胞菌的Ct 值分別為18.22、18.31、18.27，變異系數為0.20%，均小于2%，表明該方法重復性良好。結果見圖5～6。

圖5 金黃色葡萄球菌重復性試驗結果

圖6 銅綠假單胞菌重復性試驗結果

3.4 控制菌檢查方法結果 采用建立的雙重熒光PCR 方法和藥典規定的控制菌檢驗方法，對來自40 個藥廠的271份國家藥品評價性抽驗麝香壯骨膏同時進行檢驗，2 種方法均未檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，結果一致。

4 討論

藥品中污染微生物是評價藥品質量和安全性的重要指標，藥品控制菌檢查是對微生物污染進行定性檢測［19］，隨著GMP、《中國藥典》 和相關技術指南的不斷提高，對于藥品及其生產過程中微生物的檢測、鑒定和溯源的要求，分子生物學方法開始應用于藥品微生物檢驗中來。

本研究建立的雙重實時熒光PCR 方法，確定了反應體系和反應參數，通過對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌與樣品和環境中污染概率較大，一些生化反應相同的干擾菌株同時進行檢驗，表明該方法特異性高，滿足日常檢驗需求。實時熒光PCR 檢測下限為10～100 cfu［20］。本研究建立的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌檢測限分別可達到20、10 cfu／mL，具有良好的靈敏度。但熒光PCR 法也存在不足，傳統的生化檢驗方法，活菌能夠被培養，進而被分離鑒別，而死菌不能夠被培養，也就無法被檢測到。由于滅菌工藝的不同，死菌可能殘留在樣品中，通過熒光PCR 方法死菌也會被檢測到而判定為陽性。這也可能是熒光PCR方法沒有被廣泛應用于的藥品控制菌檢驗中的原因之一。

麝香壯骨膏工藝中雖無滅菌工藝，但由于制法中藥品原料都經過熬制微生物污染可能小，輔料與包裝過程可能存在污染。雖然沒有陽性結果數據，通過陰性結果數據表明熒光PCR 方法具有靈敏、快速特點，提高了藥品日常檢驗工作的效率，對日常的藥品微生物檢驗工作中，大批量相同樣品的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的污染的初篩，雙重熒光PCR 法能夠提供有效的幫助，也為今后建立不同組合和更多控制菌的同步檢測打下了良好基礎。