白及抗炎藥效部位在骨關節炎治療中的作用及機制研究

吳園園 徐紅仙 黎曉梅 彭蘇玉 王佳茂 蔣福升 葉建晨

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種常見的慢性退行性關節疾病，以疼痛、腫脹、活動障礙為主要癥狀［1］。其發病機制復雜多樣，但基本認同炎癥反應在疾病初始階段扮演重要作用。中藥白及具有收斂止血、消腫生肌等功效，對諸多內外損傷均具有促修復作用［6-7］。前期研究發現，白及醇提物可顯著抑制白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子（TNF-α）等炎癥因子表達，發揮對SiO2誘導的肺纖維化抑制作用［2］；PM2.5［3］和脂多糖（LPS）［4］誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥模型進一步確證了其對白介素-6（IL-6）、IL-1β和TNF-α等炎癥因子的顯著抑制活性；其中貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、3’-O-甲基山藥素Ⅲ和3-羥基-5-甲氧基聯芐等成分是白及發揮抗炎活性的重要功效物種［5-6］，且白及中含量較高［7］。通過進一步系統研究，制備了一個富含上述成分的白及藥效部位（EFBS），其對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥模型和小鼠急性肺損傷模型表現出顯著的抗炎活性和肺損傷保護作用［8］。而IL-1β是與OA密切相關的炎癥因子，其可刺激軟骨細胞分泌IL-6、MMP13等因子，促進蛋白聚糖和II型膠原降解，引發關節炎［9］。因此，本文采用UPLC-QTOFMS對EFBS作進一步成分解析，并通過制備IL-1β誘導的軟骨組織和ATDC5細胞炎癥模型探討EFBS是否對骨關節炎具有潛在治療作用及其可能分子機理。

1 材料與方法

1.1 細胞和動物 小鼠成軟骨細胞（ADTC5），上海澤葉生物科技有限公司；雄性ICR小鼠（20±2）g，上海BK公司。

1.2 儀器及試劑 生物組織石蠟包埋機、熒光定量PCR儀和CO2生物培養箱（賽默飛世爾科技公司）；多功能酶標儀（Perkin Elmer公司）；ACQUITY超高效液相色譜和SYNAPT G2-Si Q-TOF 質譜儀（Waters公司）；輪轉式切片機（Lecia公司）；白及采自湖北梅川鎮，經張春椿副教授鑒定為蘭科植物白及Bletilla striata （Thunb.）Rei chb.f.的假鱗莖；BD-CBA小鼠炎癥因子檢測試劑盒（美國BD公司）；DMEM/F12培養基、胎牛血清（Gibco公司）；ITS誘導劑（Sigma公司）；反轉錄試劑盒（Takara公司）；引物（COL2A1、MMP13、GAPDH）由上海生工合成；色譜純乙腈和甲酸（默克公司）；其它試劑均為分析純。

1.3 方法 （1）EFBS制備和化學成分表征：按照實驗室先前建立的方法，制備EFBS［8］。精密稱取EFBS并溶解稀釋成1.0 mg/mL，過0.22 μm濾膜，進樣作UPLC-QTOF-MS分析。色譜條件為：Waters ACQUITY UPLC Cortecs T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm，Waters），保護柱為Cortecs T3 Van Guard（2.1×50 mm，1.7 μm，Waters）；流動相為A（乙腈）和B（0.1%甲酸溶液）梯度洗脫，即0～36 min，20%～100% A；流速0.30 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量為2 μL。質譜檢測條件：SYNAPTG2-SiQ-TOF質譜儀，電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式；脫溶劑氣流量為1,000 L/h，脫溶劑氣溫度為500 ℃；離子源溫度120 ℃；錐孔電壓：20.0 V；毛細管電壓：3.0 kV（+）；采用Waters公司Lockspray校正系統，亮氨酸-腦啡肽（［M+H］+=556.2771，2 ng/mL）為標準物進行在線實時質量校正；質量掃描范圍（m/z）：50～1500 Da，掃描時間0.2 s；采用MassLynxV 4.1工作站進行數據采集處理。（2）EFBS對IL-1β誘導的小鼠關節軟骨炎癥因子和膠原降解抑制作用：①IL-1β誘導的小鼠關節軟骨炎癥模型建立：ICR小鼠頸椎脫臼處死，70%乙醇消毒，解剖取股骨頭軟骨；用含雙抗的PBS潤洗3次，無菌PBS潤洗后，轉入96孔板（1個/孔），加入200 μL DMEM預培養2 d；更換培養液后加入不同濃度IL-1β刺激4 d（每個處理6個軟骨），取上清CBA法測定細胞因子水平。軟骨10%中性福爾馬林固定48 h，10% EDTA脫鈣軟化，流水沖洗，常規石蠟包埋切片，番紅-固綠染色觀察軟骨膠原降解情況，確定IL-1β處理濃度。②EFBS藥效評價：按上述方法進行軟骨培養，不同濃度EFBS預培養2 h，加入IL-1β刺激培養4 d，取上清CBA法測定炎癥因子水平，軟骨固定、脫鈣、切片作番紅-固綠染色，分析EFBS抗炎、抑制膠原降解情況。（3）EFBS對IL-1β誘導ADTC5細胞膠原降解抑制作用及分子機制：①EFBS對ADTC5細胞生長影響：取指數生長期ADTC5細胞，DMEM培養基培養，完全鋪滿瓶底后更換成DF12分化培養基（含1% ITS），每3 d更換1次，誘導分化培養21 d。胰酶消化后用DF12分化培養基調整細胞密度，以5×105個/孔接種96孔板；培養過夜后加入不同濃度EFBS，培養24 h后采用CCK-8法測定細胞存活率。②EFBS對IL-1β誘導ADTC5細胞膠原降解抑制作用：取誘導分化培養21 d的ADTC5細胞，用分化培養基調整細胞密度，以5×105個/孔接種12孔板；培養過夜后加入不同濃度EFBS預培養2 h，加入終濃度為10 ng/mL的IL-1β刺激培養3 d。去上清液，4%多聚甲醛固定30 min，PBS潤洗3次，加1%阿利新藍染色30 min，PBS潤洗3次，拍照分析膠原降解情況［10］。③EFBS對Ⅱ型膠原蛋白α1（COL2A1）和基質金屬蛋白酶13（MMP13）基因表達影響：按照上述方法傳板，藥物預處理和IL-1β刺激培養3 d；去上清液，預冷PBS潤洗2次，根據試劑盒說明書操作，Trizol法提取總RNA，逆轉錄成cDNA，熒光定量PCR測定COL2A1和MMP13基因表達情況。

1.4 統計學方法 采用GraphPad Prism 6統計軟件分析處理實驗結果，計量資料以（）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EFBS質譜表征 EFBS經UPLC分離QTOF-MS檢測，其基峰離子色譜圖如圖1所示。通過查閱文獻建立白及化合物庫，MassLynxV 4.1軟件搜庫比對作初步鑒定，并進一步通過分析各峰保留時間，化合物裂解規律、標準品對照及與文獻中相關數據比對分析，共鑒定了12個峰物質，其中菲類和聯芐各6個。

圖1 EFBS正離子模式的基峰離子色譜圖

2.2 EFBS對IL-1β誘導的關節軟骨炎癥因子分泌和基質降解抑制作用 IL-1β可劑量依賴性促進關節軟骨釋放IL-6和MCP-1，但20 ng/mL和40 ng/mL無顯著性差異（P＞0.05）（圖2 A-B）；切片番紅-固綠染色結果表明，正常組軟骨基質染色均勻呈深紅色，5 ng/mL IL-1β刺激切片外緣染色明顯變淺呈粉紅色，表明膠原基質降解明顯；而＞10 ng/mL切片外緣幾乎呈白色，但繼續增加濃度變化并不明顯（P＞0.05）（圖2 C）；從文獻資料看，大多研究采用10 ng/mL IL-1β刺激［11］，因此，確定該濃度用于后續研究。與模型組比較，EFBS預處理可劑量依賴性抑制IL-1β誘導的IL-6和MCP-1升高（P＜0.05），其中40 μg/mL處理組兩個因子抑制率分別達88.736%±19.305%和69.189%±26.366%（圖2 D、E）。切片結果表明，EFBS也可劑量依賴性抑制膠原基質降解（圖2 F）。

圖2 軟骨培養上清液中炎癥因子水平及軟骨切片番紅-固綠染色結果。注：A、B中與對照組比較，**P＜0.01；D、E中與模型組比較，**P＜0.01

2.3 EFBS對IL-1β誘導的ATDC5細胞膠原蛋白降解抑制作用 CCK-8結果表明，EFBS在50 μg/mL劑量范圍內對ATDC5細胞存活率無顯著影響（P＞0.05），但60 μg/mL濃度時相比對照組存活率顯著下降（P＜0.05）（圖3 A）。10 ng/mL IL-1β處理后，經阿利新藍染色與對照組相比顯著變淺，而20～40 μg/mL濃度范圍內隨EFBS劑量增加染色明顯加深，表明EFBS對IL-1β誘導的膠原蛋白降解具有較好的抑制作用（圖3 B）。

圖3 EFBS對ATDC5細胞存活率影響及對IL-1β誘導的ATDC5細胞基質降解抑制作用。注：A. 細胞存活率，與對照組比較，**P＜0.01；B. ATDC5細胞基質阿利新藍染色

2.4 EFBS對COL2A1和MMP13基因表達影響 熒光定量PCR結果表明IL-1β誘導可顯著下調COL2A1基因表達，同時促進MMP13基因表達（P＜0.05）；EFBS可劑量依賴性上調COL2A1基因mRNA水平，尤其40 μg/mL處理組甚至超過正常對照組（P＜0.05）（圖4 A）；雖然相比模型組EFBS各劑量組MMP13基因表達水平均顯著降低（P＜0.05），但并不呈劑量關系，30 μg/mL表達量最低，而40 μg/mL處理組又有所升高，但與正常組相當（圖4B）。

圖4 EFBS對COL2A1和MMP13基因表達影響。注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

3 討論

HPLC分析表明貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、3’-O-甲基山藥素Ⅲ和3-羥基-5-甲氧基聯芐四個成分含量＞50%［8］，但其余成分尚不清楚；本研究通過UPLCQTOF-MS進一步對EFBS化合物組成進行了表征。結果共鑒定了12個峰，菲類和聯芐類是其主要成分，這為進一步制備成分基本清楚、含量相對穩定、療效確切的白及藥物制劑奠定了良好基礎。

OA的發生、發展與多種因素有關，多是由于關節局部損傷、炎癥、長期慢性勞損或軟骨組織新陳代謝失衡造成［12］，但確切機制不完全清楚。藥物注射誘導、關節制動或撞擊和手術方法等建立的各種關節炎模型為闡明OA發病機制和藥效評價奠定了良好基礎［13］。但動物模型周期較長，成本高，也不利于高通量篩選，在這方面體外組織、細胞模型具有獨特優勢，同時也是對體內模型的重要補充［14］。軟骨組織對于關節功能的發揮至關重要，當關節軟骨損傷后，力的吸收作用降低，關節損傷、退變會進行性加重。軟骨細胞是關節軟骨中唯一存在的細胞，其功能失調與骨關節炎發生、發展密切相關。大量研究表明，關節炎患者關節腔內IL-1β水平異常升高，其可誘導軟骨細胞分泌IL-6、MMP13等因子，從而導致關節軟骨基質降解，軟骨細胞凋亡，最終形成關節炎［15］。因此，本研究首先采用IL-1β誘導的關節軟骨炎癥模型，從組織水平探究白及EFBS對其保護作用；結果表明，EFBS可劑量依賴性抑制IL-1β誘導的IL-6和MCP-1炎癥因子分泌和軟骨基質降解。進一步采用IL-1β誘導的ATDC5軟骨細胞模型進行驗證，結果表明EFBS在20～40 μg/mL范圍內也可劑量依賴性抑制膠原基質降解。

IL-1β可通過誘導MMPs，尤其MMP13促進II型膠原蛋白降解，同時其也可抑制II型膠原蛋白合成進一步加劇軟骨基質降解［16］；因此，本研究采用熒光定量PCR技術對COL2A1和MMP13基因表達情況進行了初步分析。結果表明，IL-1β刺激顯著上調MMP13 mRNA水平，并抑制COL2A1基因表達從而減少膠原沉積，使得阿利新藍染色變淺；而EFBS處理可劑量依賴性增加COL2A1 mRNA水平，同時顯著抑制MMP13基因表達，使得阿利新藍染色加深。可見，EFBS可抑制炎癥因子的分泌和MMP13的表達，同時促進II型膠原蛋白合成等多個方面抑制軟骨基質的降解；結果表明EFBS在治療OA疾病方面具有潛在應用價值，值得進一步深入系統研究。