整合網(wǎng)絡(luò)分析構(gòu)建胃癌自噬相關(guān)預(yù)后模型

戴玉樑 舒鵬 李文杰 張冉冉

胃癌（Gastric cancer，GC）是最常見的惡性腫瘤之一，每年約一百萬新發(fā)胃癌病例［1-2］。東亞地區(qū)每年的新發(fā)病例占全球50%之多［1，3-4］，男性的發(fā)病率高于女性［5］。由多種因素導(dǎo)致胃癌發(fā)生，包括幽門螺桿菌感染［6］、EB病毒感染［7］等。手術(shù)的提升及放療、化療等輔助治療技術(shù)的應(yīng)用一定程度改善胃癌患者的預(yù)后，然而5年生存率提高有限，可至30%左右［8］。胃癌可被聚類為四種共識分子亞型，分別為微衛(wèi)星不穩(wěn)定亞型、TP53活性亞型、TP53失活亞型和間充質(zhì)亞型，其中囊括彌漫性亞型胃癌在內(nèi)的間充質(zhì)樣亞型預(yù)后最差［9］。傳統(tǒng)的TNM分期在用于胃癌患者的預(yù)后預(yù)測方面日趨乏力［10-11］。許多證據(jù)表明，胃癌患者對治療的反應(yīng)和生存表現(xiàn)很大程度上依賴于一些遺傳分子特征［12-13］。基于基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，研究人員陸續(xù)開發(fā)了一些用于胃癌預(yù)后預(yù)測的分子標(biāo)志物［14-15］。然而，受限于胃癌異質(zhì)性，大部分標(biāo)志物的預(yù)后預(yù)測效果不佳。自噬廣泛參與細(xì)胞質(zhì)成分的降解和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性的維持，在許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［16-17］。已有大量關(guān)于自噬在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和耐藥性方面的機制研究［18-19］。本研究對間充質(zhì)亞型胃癌內(nèi)在特征和自噬相關(guān)基因進(jìn)行整合研究，旨在開發(fā)出穩(wěn)定可靠的預(yù)后標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 患者隊列 使用“GEOquery”包從GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫中獲取患者的基因表達(dá)譜和相應(yīng)的臨床信息，并經(jīng)過RMA（robust multiarray analysis）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。5組獨立GSE（GEO Series）數(shù)據(jù)集被納入本研究，共包含1,099例GC患者的基因表達(dá)譜。分別是：GSE15459（n=192），GSE26901（n=109），GSE13861（n=65），GSE84437（n=433），GSE62254（n=300）。基因表達(dá)譜中的探針I(yè)D被轉(zhuǎn)換為基因符號；若有多個探針I(yè)D對應(yīng)同一個基因符號，則保留平均值最高的ID用于表示相應(yīng)的基因。GSE15459和GSE62254數(shù)據(jù)集的分子亞型信息檢索自Cristescu等的研究［9］。納入患者的詳細(xì)臨床特征見表1。本研究的設(shè)計和分析流程如圖1所示。

圖1 本研究的設(shè)計和分析流程

表1 患者臨床信息統(tǒng)計

1.2 整合網(wǎng)絡(luò)分析 從HADb數(shù)據(jù)庫（http：//autophagy.lu/autophagy.html）中獲取232個自噬基因。GSE15459作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，本研究發(fā)現(xiàn)與其他三種亞型相比（MSI，TP53-，TP53+），在間充質(zhì)亞型中有17種ATGs（log 2FC＞1，adjP＜0.05）和1,865種靶基因（log 2FC＞0.15，adjP＜0：05）差異表達(dá)。通過主調(diào)控分析，計算每個自噬基因與其靶基因中的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的超幾何檢驗P值，篩選自噬標(biāo)志基因。

1.3 構(gòu)建和驗證基于自噬基因的胃癌預(yù)后標(biāo)志物（autophagy gene-based signature for gastric cancer，APSGC） 整合自噬標(biāo)志基因與患者總體生存期，通過COX風(fēng)險回歸分析構(gòu)建一個自噬相關(guān)預(yù)后模型用于患者風(fēng)險賦分，命名為“基于自噬基因的胃癌預(yù)后標(biāo)志物（APSGC）”，該模型的計分方程如下：風(fēng)險評分=Xi×Yi（X：每個基因的表達(dá)水平，Y：每個基因的Cox回歸系數(shù)）。同時，在GSE26901、GSE13861、GSE84437及GSE62254四組數(shù)據(jù)集中進(jìn)行APSGC賦分并驗證預(yù)后預(yù)測效能。

1.4 基因集富集分析 從MSigDB數(shù)據(jù)庫下獲取hallmark和kegg基因集，使用“fgsea”包完成，表型定義相關(guān)基因集數(shù)目設(shè)定為1,000。設(shè)定P＜0.05篩選顯著的基因集。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用R 3.6.1統(tǒng)計軟件。使用Student′st-test計算組間基因表達(dá)差異。使用Kaplan-Meier生存曲線比較高危組和低危組間生存差異，“survival”R包中的log-rank檢驗統(tǒng)計顯著性。使用Cox模型進(jìn)行單變量比例風(fēng)險回歸分析。對于所有的檢驗分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 整合網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)樣亞型的5個自噬標(biāo)志基因 GSE15459作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，234個自噬基因中有54個基因的單變量風(fēng)險比＞1。差異分析表明，與其他三種亞型相比，間充質(zhì)亞型中存在1,412個差異靶基因（log2FC＞1；adjP＜0.05）和17個差異自噬標(biāo)志基因（log2FC＞0.15；adjP＜0.05）。經(jīng)過網(wǎng)絡(luò)分析和主調(diào)控分析的篩選（表2），保留了5個主調(diào)控間充質(zhì)亞型的自噬基因（CCL2，SPHK1，ITGB1，PEA15，DLC1）（圖1）。相較于其他亞型，這5個自噬標(biāo)志基因在間充質(zhì)樣亞型中顯著高表達(dá)（圖2）。基于這5個自噬基因的表達(dá)，能夠較好地預(yù)測間充質(zhì)樣亞型（圖3A），且每個基因皆是患者的RFS風(fēng)險因素（圖3B）。

圖2 整合網(wǎng)絡(luò)分析篩選出5個自噬標(biāo)志基因。A. 訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中不同亞型胃癌間5個自噬基因的表達(dá)情況；B. GSE15459和GSE62254數(shù)據(jù)集中這5個基因在不同亞型間的表達(dá)情況

圖3 5個自噬標(biāo)志基因的亞型識別和預(yù)測效能。A：基于這5個基因的表達(dá)，在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中可以較好地鑒定間充質(zhì)樣亞型；B：單變量分析中，這5個基因?qū)颊逺FS的預(yù)測效果

表2 主調(diào)控分析結(jié)果

2.2 自噬相關(guān)預(yù)后模型（APSGC）的構(gòu)建與驗證 整合這5個自噬標(biāo)志基因與患者的總體生存期，通過多因素Cox構(gòu)建了一個自噬相關(guān)預(yù)后模型（APSGC）。風(fēng)險評分=（0.074,7×CCL2）+（0.121,4×SPHK1）+（0.996,6×ITGB1）+（0.150,3×PEA15）+（-0.131,5×DLC1）。對數(shù)據(jù)集中的患者進(jìn)行風(fēng)險賦分。在每個數(shù)據(jù)集中，風(fēng)險賦值的上四分位數(shù)設(shè)定為閾值，依此將患者分為高危組和低危組。在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中，高危組的總體生存期顯著低于低危組（P＜0.05）（圖4A）。

圖4 不同風(fēng)險組之間的生存差異。A-F. 不同風(fēng)險組之間總體生存期方面的差異；G-I. 不同風(fēng)險組之間無復(fù)發(fā)生存期方面的差異

進(jìn)一步在4組驗證數(shù)據(jù)集上評估APSGC的預(yù)后預(yù)測效能。結(jié)果表明，在驗證數(shù)據(jù)集中，高危組的總體生存期顯著低于低危組（P＜0.05）（圖4B、C、D、E）。在將所有驗證數(shù)據(jù)集整合后，發(fā)現(xiàn)在合集中高危組和低危組的總體生存期仍有顯著差異（圖4F）。而在無復(fù)發(fā)生存期方面，高危組也顯著低于低危組（P＜0.05）（圖4G、H、I）。此外，在納入年齡、性別、分期等臨床因素后，單變量和多變量Cox分析表明，APSGC是一個獨立預(yù)后因素（表3）。

表3 自噬標(biāo)志及臨床風(fēng)險特征的單變量和多變量分析

2.3 APSGC功能分析 結(jié)果表明，在高危組中，許多和間充質(zhì)相關(guān)的通路，如TGF-β通路、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、mTOR通路等顯著上調(diào)（P＜0.05）（圖5）。

圖5 高危和低危組的GESA結(jié)果

3 討論

胃癌是癌癥相關(guān)死亡的第三大病因［2］，早期胃癌治療效果好，而中晚期胃癌則由于切除后的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移而預(yù)后較差，其五年整體生存率＜5%［20］。目前研究人員已開發(fā)出若干種基于多基因的預(yù)后標(biāo)志物［21-22］，但其預(yù)測效果仍不明確。需要開發(fā)出一類優(yōu)于TNM分期的預(yù)后標(biāo)志物，對胃癌患者實現(xiàn)風(fēng)險分層，指導(dǎo)個體化和精準(zhǔn)治療。

本研究中，作者整合分析了間充質(zhì)樣亞型胃癌的分子亞型信息和自噬基因，篩選出間充質(zhì)樣亞型中的主調(diào)控自噬基因，構(gòu)建了自噬相關(guān)的胃癌預(yù)后標(biāo)志物（APSGC），利用癌癥組織轉(zhuǎn)錄譜的獨特性質(zhì)來推斷腫瘤自噬狀態(tài)，用于患者風(fēng)險分層。大量的研究表明，這5個基因在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用。例如CCL2的激活促進(jìn)了肺癌的轉(zhuǎn)移［23］，SPHK1在POTEE的驅(qū)動下促進(jìn)了結(jié)直腸癌的進(jìn)展［24］。ITGB1的抑制導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞凋亡，并減少癌組織內(nèi)血管生成［25］，胃癌順鉑類藥物耐藥性的產(chǎn)生和PEA15的高表達(dá)相關(guān)［26］，DCL1的表達(dá)和卵巢癌的進(jìn)展和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)［27］。這些證據(jù)反映了作者構(gòu)建的預(yù)后標(biāo)志物蘊含著可靠的生物學(xué)意義。經(jīng)過APSGC的分層，可觀測到相較于低危組，高危組的整體生存期和無復(fù)發(fā)生存期更差，在幾個獨立的驗證隊列中也觀察到同樣的結(jié)果。基因富集分析表明，與間充質(zhì)相關(guān)的通路，如TGF-β信號通路、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、自噬正調(diào)控等通路在高危組中顯著上調(diào)。此外，在將患者性別、年齡、分期等變量納入多因素回歸分析后，表明APSGC是一個獨立預(yù)后預(yù)測因素。這些結(jié)果表明APSGC是一種可靠的胃癌預(yù)后模型。本研究將自噬狀態(tài)與患者預(yù)后聯(lián)系起來，為胃癌患者的臨床精準(zhǔn)治療提供指導(dǎo)。

然而本研究的缺陷和不足仍不容忽視。首先，納入的數(shù)據(jù)集均來自于微陣列和測序的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，高昂的檢測價格、復(fù)雜的數(shù)據(jù)前處理過程以及專業(yè)的生物信息學(xué)分析要求限制了其在臨床一線的推廣應(yīng)用。其次，本研究是一項回顧性分析，進(jìn)一步的驗證需要納入更多的前瞻性隊列。在未來的研究中，作者將進(jìn)一步通過分子生物學(xué)實驗探究模型的內(nèi)在分子機制，同時納入多中心樣本，對模型進(jìn)行提升和完善。