雷公藤紅素通過下調FAT10抑制結直腸癌細胞增殖促進凋亡的研究

王雪麗 張昱 郝榮榮 胡英男 王建偉 張威

結直腸癌（CRC）是常見的惡性腫瘤之一，其發病率位居全球新發癌癥的第三位，約為10.2%，死亡率位列全球第二，約為9.2%［1］。近年，我國結直腸癌的發病率和死亡率還在逐年上升，且呈現年輕化趨勢，已經成為嚴重的公共衛生問題［2］。研發新型治療藥物有望使我國CRC患者在臨床治療中有更大獲益，并且減輕醫療和社會的負擔。人白細胞抗原F位點相鄰轉錄本10（FAT10）是一種類泛素樣蛋白，其功能類似于泛素化蛋白，是蛋白酶體靶向的標簽［3］。有研究表明FAT10在多種腫瘤中高表達，例如膠質瘤、肝細胞癌、乳腺癌、胰腺癌和胃腸道癌，表明其可能參與癌癥發展的途徑［4-5］。然而，FAT10與細胞惡性轉化和進展之間的聯系尚未確定。雷公藤紅素（Cel）是一種從雷公藤植物中分離的一種活性成分，具有廣泛的生物學特性，如抗腫瘤、免疫抑制和減肥活性［6-7］。《Cell》雜志曾將Cel評價為最有可能開發為現代藥物的天然化合物之一［8］。然而，Cel對FAT10表達的影響并未報道，本文旨在研究Cel在結直腸癌中的作用，尤其是對FAT10的調控。

1 材料與方法

1.1 材料 人源結直腸癌細胞株SW480、HCT116，購買自武漢普諾賽生命科技有限公司；Cel，批號（HC020128），純度＞98%，購買自辰光生物科技有限公司；DMEM培養基、青霉素和鏈霉素、胰蛋白酶，全購自美國HyClone公司；胎牛血清購自以色列Biolnd公司；FAT10一抗、GAPDH一抗、辣根過氧化物酶標記兔二抗，購自中國杭州華安生物公司；細胞計數試劑-8（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒、RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF），購自碧云天生物技術有限公司；細胞凋亡試劑盒，購自杭州聯科生物技術股份有限公司；M-MLV反轉錄預混試劑盒和SYBR Green qPCR試劑盒購自湖南艾科瑞生物公司；ECL發光液購自弗德生物科技有限公司。

1.2 方法 （1）細胞培養：SW480和HCT116細胞在含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養介質中，細胞傳代后放置在37℃、5%CO2的培養箱中。（2）Cel溶液配制：精確稱取Cel約45.0609 mg溶于精密移取的1 mL DMSO溶液中配置成100 mM的母液，分裝凍存于-20℃。（3）細胞毒性實驗：將狀態良好的處于對數生長期的SW480、HCT116細胞消化后鋪在96孔板中（5,000個/孔），細胞貼壁后用梯度稀釋法配制不同濃度的Cel（0、0.315、0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L）處理，Cel作用24 h后，吸除舊培養基，每孔添加90 μL新鮮DMEM和10 μL CCK8溶液，37℃避光孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm處的吸光度（A）值。細胞活力（%）=［A（加藥組）-A（空白組）］/［A（對照組）-A（空白組）］×100%。（4）細胞凋亡檢測：將細胞培養于12孔板，加入不同濃度的Cel和不含藥物組，待藥物作用24 h后，按照凋亡試劑盒說明書用Annexin V-FITC/PI染色，然后采用流式細胞術檢測細胞的凋亡情況。（5）實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測FAT10的表達：采用Trizol試劑提取細胞總RNA，之后按照說明書步驟用逆轉錄試劑預混液合成cDNA。以該cDNA為模板，使用SYBR Green進行實時熒光定量PCR實驗，采用2-ΔΔCt法計算FAT10 mRNA的相對表達量。FAT10引物：正向序列為 5′-CTTGTGGAGTCAGGTGATG-3’，反向序列為5′-CCATTGCAAGTCACAATCTG-3’。GAPDH引物：正向序列為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，反向序列為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。（6）Western Blot實驗：采用RIPA裂解液提取細胞蛋白并BCA定量。10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離等量的蛋白樣品，然后轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別用相應的一抗4 ℃孵育過夜，FAT10單抗（18 kDa；1∶1,000）、GAPDH抗體（36 kDa；1∶10,000）。室溫下與HRP結合的二級抗體孵育1 h。TBST洗滌3次后，用ECL發光液檢測，并使用Bio-Rad圖像系統獲取蛋白質條帶。

1.3 統計學方法 每種實驗均重復≥3次，并采用GraphPad Prism 8.0進行統計繪圖分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 FAT10在結直腸癌細胞系中的表達 在mRNA水平上檢測了正常結腸上皮細胞NCM460和5個結直腸癌細胞系中FAT10的表達。FAT10 mRNA在這些細胞系中表達不同，在腫瘤細胞中的表達明顯高于正常結腸上皮細胞（P＜0.01，見圖1）。結果表明，FAT10基因在結直腸癌中高表達并且差異具有統計學意義。

圖1 RT-qPCR分析腸上皮細胞和結直腸癌細胞中FAT10 mRNA的表達（注：*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 Cel對SW480和HCT116細胞增殖的影響 用不同濃度Cel（0、0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L）分別作用SW480、HCT116細胞24 h后，相對于對照組的0 μmol/L，隨著藥物濃度增加細胞活力顯著下降（P＜0.05，見圖2）。根據Cel對SW480和HCT116細胞的毒性影響，當藥物濃度＞10 μmol/L時，其抑制作用可以到達90%以上。計算IC50各自為3.03、1.63 μmol/L。后續實驗的藥物劑量根據IC50做參考，SW480選用0、1.25、5 μmol/L而HCT116選用0、1.25、2.5 μmol/L。

圖2 不同濃度的Cel對SW480和HCT116細胞增殖的影響（注：*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3 Cel對SW480和HCT116細胞凋亡的影響 用貝克曼流式細胞儀，檢測1.25、5 μmol/L Cel處理SW480和1.25、2.5 μmol/L Cel處理HCT116細胞24 h后的凋亡情況，SW480細胞與對照組的晚期凋亡率5.35%相比，給藥組的晚期凋亡率分別為25.2%、75%（P＜0.01，見圖3A、B），HCT116細胞的凋亡占比也隨著Cel濃度的增高而增大（P＜0.01，見圖3A、C）。說明Cel能顯著誘導結直腸癌細胞凋亡。

圖3 不同濃度的Cel對SW480和HCT116細胞凋亡的影響（注：*P＜0.05，**P＜0.01）

2.4 Cel對FAT10表達的影響 有研究發現FAT10在幾種癌癥中呈高表達，下調其表達可能是一種潛在的癌癥治療手段。因此，在本研究中作者檢測了Cel是否對FAT10表達產生影響。以SW480和HCT116細胞為研究對象，RT-qPCR結果表明，與Cel未處理的細胞相比，FAT10 mRNA在Cel處理的細胞中表達下降，而當Cel濃度為1.25 μmol/L時，FAT10 mRNA表達明顯降低（P＜0.05，見圖4A、B）。為了進一步研究Cel是否會對FAT10產生作用，通過Western blot實驗，檢測其蛋白的表達情況。圖4C、D的Western blot條帶顯示隨著藥物濃度升高，FAT10條帶的灰度值隨之下降，說明Cel對FAT10蛋白有抑制作用。這與FAT10 mRNA表達的趨勢是一致的。以上研究結果提示Cel可能通過觸發FAT10的下調導致的結直腸癌細胞的凋亡。

圖4 不同濃度的Cel對FAT10表達的影響（注：*P＜0.05，**P＜0.01）

3 討論

研究表明，泛素樣修飾劑FAT10直接參與調節癌癥的發展途徑［9-10］。最近報道，FAT10在胰腺癌中的表達增加與TNM晚期和總生存期降低有關，并通過功能實驗表明，下調FAT10的表達可抑制胰腺癌細胞的增殖和上皮-間充質轉化，促進胰腺癌細胞凋亡，增強腫瘤化療的耐藥性［11］。此外，FAT10是癌癥和炎癥研究和治療的重要靶標，涉及FAT10對炎癥誘導的腫瘤發生的潛在作用。由于FAT10與炎癥信號通路之間的聯系，最終導致肝細胞癌的發展［12］。REN等［13］發現，TNF-α激活NF-κB通路，該通路導致細胞中的FAT10基因表達并導致腫瘤發生。沉默FAT10顯著抑制骨肉瘤細胞的侵襲和遷移能力［14］。這些研究強烈表明FAT10可用作腫瘤疾病的預后標志物，并且是潛在的治療靶點。值得注意的是，FAT10可以通過改變凋亡途徑在促生存途徑中發揮作用。DONG等［15］報道了FAT10直接結合并穩定Survivin蛋白，從而通過抑制泛素介導的降解來促進癌細胞增殖，揭示了FAT10通過直接穩定膀胱癌中的Survivin蛋白來促進腫瘤增殖的新機制。同時，FAT10在染色體穩定性的調節中發揮作用，FAT10表達的失調將導致G2/M細胞周期階段控制的失調，從而導致細胞分裂過程中染色體的異常分布，增強癌細胞的存活、增殖及轉移［16］。

目前，可以有效治療CRC的潛在藥物正在不斷探索中。有文獻記載的古代草藥的有用性使得藥用植物成為藥物發現的潛在來源。許多由植物分離物制備的重要化療藥物已被用于治療各種類型的癌癥。因此，草藥植物提取物可能是開發抗癌藥物的一個有前途的來源。此前已經證明，Cel對多種癌癥產生有益作用，表明可能使用其來開發潛在的抗癌治療方法［17］。在各種腫瘤模型中，Cel已被證明通過抑制細胞增殖、誘導凋亡和抑制血管生成來調節腫瘤生長。CHEN等［18］研究發現Cel對過氧化還原酶-2（PRDX2）的抑制增加了細胞活性氧（ROS）水平，并導致ROS依賴性內質網應激，線粒體功能障礙和胃癌細胞凋亡。LIU等［19］報道了Cel通過神經膠質瘤細胞中的ROS/JNK和AKT/mTOR信號通路介導自噬和凋亡。ZHANG等［20］報道了Cel增強了轉錄因子EB（TFEB）介導的自噬和溶酶體生物發生，改善了微管相關蛋白tau病理學，表明Cel是治療阿爾茨海默病有前途的候選藥物。此外，Cel可以通過靶向過氧化還原酶-1（PRDX1）抑制結直腸癌細胞的增殖，PRDX1的抑制導致細胞內ROS升高以及細胞周期停滯和凋亡增加［21］。然而，關于Cel在CRC中的潛在抗癌作用及其作用機制仍存在許多尚不明確的問題。先前揭示的靶點和機制表明，Cel通過不同癌細胞中的不同靶點發揮抗腫瘤功效，但是Cel對FAT10表達的影響尚未見報道。因此，本研究旨在評估Cel對CRC的治療作用，重點是對FAT10的調控。

在本研究中，作者發現Cel對結直腸癌細胞的增殖具有顯著的抑制作用，而且還能明顯促進結直腸癌細胞的凋亡。值得注意的是，進一步通過RT-qPCR和Western blot檢測發現，Cel能夠下調FAT10的表達。本研究證實了雷公藤素能夠抑制CRC的發展，這可能是通過抑制FAT10基因表達來逆轉的。雖然這項研究取得了有價值的結果，但仍存在不足和局限性。本研究結論主要是基于對CRC細胞分子水平的研究，需要更多體內和體外實驗相結合來探究FAT10蛋白發揮的獨特功能和機制。

總之，本研究證明了FAT10在CRC細胞中的表達水平升高，Cel能夠抑制CRC細胞的增殖促進凋亡，其作用的機制可能與下調FAT10表達有關，這是以前在文獻中未報道過的。深入探索FAT10與Cel作用之間的關系，了解Cel誘導的CRC細胞凋亡的具體機制，將為開發Cel作為治療CRC的潛在候選藥物提供了新的見解。總之，本研究為FAT10抑制作用對Cel誘導的CRC細胞活性抑制的發生提供了初步證據，并且表明Cel可能作為開發FAT10抑制劑的先導化合物。