LncRNA LOC344887在非小細胞肺癌組織中的表達及對非小細胞肺癌細胞生長的影響

岳靜 陳雪琴 程卓安

據最新癌癥統計數據，肺癌仍是全球癌癥死亡的主要原因［1］。肺癌中80%～85%的分型為非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC），而肺腺癌和肺鱗狀細胞癌（簡稱肺鱗癌）是NSCLC中的兩種主要組織學亞型。長非編碼RNA（long non- coding RNA，lncRNA）是一類長度＞200個核苷酸的非編碼RNA（non- coding RNA，ncRNA），其表達具有細胞和組織特異性［2］，并且參與調控多種癌癥增殖、凋亡、轉移等過程［3］，在NSCLC發生、發展中也起著關鍵作用［4］，然而，只有少數lncRNA被鑒定出來，大多數lncRNA在癌癥中的作用尚不清楚，lncRNA與NSCLC的相關性有待進一步研究。本課題組前期通過基因芯片篩選出了一個在NSCLC組織中異常表達的lncRNA LOC344887，又名NMRAL2P（NmrA like redox sensor 2），長度共1813bp，其在腫瘤中尤其是NSCLC中的表達和作用尚未闡明。本研究通過分析LOC344887在NSCLC組織中的表達及其與NSCLC預后的關系，并通過構建敲低LOC344887的NSCLC細胞模型，探討LOC344887調節NSCLC細胞生長的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及設備 （1）細胞系：人肺鱗癌細胞系NCI-H2170購自美國ATCC細胞保藏中心。（2）主要試劑與設備：Trizol（15596026CN）和LipofectamineTM 3000轉染試劑（L3000015）購自美國Invitrogen公司；PrimeScriptTM RT Master Mix RNA逆轉錄試劑盒（RR036A）與TB Green（RR420A）購自日本寶日醫生物技術（北京）有限公司；RPMI1640培養基（11875093）、FBS（10099-141）均購自美國Gibco公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）及陰性對照siRNA均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；4%多聚甲醛溶液（P0099）、結晶紫染色液（C0121）購自上海碧云天生物技術有限公司；CCK-8試劑盒（CK04）購自日本Dojindo公司；PI/RNase細胞周期染色液（550825）購自美國BD Bioscience公司。實時熒光定量PCR（ABI7500）儀購自美國ABI公司；酶標儀（SpectraMax i3）購自美國Molecular Devices公司；流式細胞儀（CytoFLEX S）購自美國Beckman公司。

1.2 實驗方法 （1）生物信息學分析：檢索ENCORI數據庫中LOC344887相關數據，共納入526例肺腺癌樣本及對應的59例正常樣本，501例肺鱗癌樣本及對應的49例正常樣本，分別比較LOC344887在NSCLC樣本與正常樣本中表達水平的差異。收集公開的癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫中NSCLC相關的基因芯片數據，根據LOC344887表達水平的中位數進行分組，高于中位數者為LOC344887高表達組，低于中位數者為LOC344887低表達組，采用Kaplan-Meier繪制生存率曲線，分析LOC344887表達水平與NSCLC患者總生存率的關系。（2）細胞培養：人肺鱗癌細胞系NCI-H2170培養于添加10% FBS、1%青鏈霉素的RPMI1640完全培養基中，并置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中進行培養。（3）siRNA轉染：按照2×105個細胞/孔的濃度接種NCI-H2170細胞至6孔板中，待細胞貼壁后，根據轉染試劑操作說明分別轉染靶向敲低LOC344887的siRNA（si-LOC344887）及對照組siRNA（si-Control）至細胞中。si-LOC344887序列如下，正義鏈：5’-GCAGUACGGGAAGGAGAUUTT-3’，反義鏈：5’-AAUCUCCUUCCCGUACUGCTT-3’。（4）實時熒光定量PCR：使用Trizol試劑提取LOC344887敲低組及對照組的細胞總RNA，根據RNA逆轉錄試劑盒操作說明將RNA逆轉錄為cDNA，然后采用TB Green進行實時熒光定量PCR檢測LOC344887的mRNA水平，以β-actin為內參標準化LOC344887的表達。相關引物序列如下，LOC344887上游引物：5’-CGTGAAAGCCTCTGATGGAGA-3’；LOC344887下游引物：5’-AGACGGCTGCTCCAATATCA-3’；β-actin上游引物：5’-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’；β-actin下游引物：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’。實時熒光定量PCR反應程序如下：95℃預變性30 s；95℃5 s，60℃ 30 s；共40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。實驗結束采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。（5）克隆形成實驗：收集LOC344887敲低組及對照組的細胞各500個接種于6孔板中，于培養箱中連續培養10 d后，棄去培養液，加入2 mL PBS清洗細胞兩次，之后加入1 mL 4%多聚甲醛溶液室溫固定細胞15 min，再加入結晶紫溶液室溫染色細胞15 min，最后棄去結晶紫染色液，并用清水洗去多余的染色液，待孔中無液體殘留時拍照記錄數據。（6）CCK8法繪制細胞生長曲線：按照1×103個/孔的濃度分別接種LOC344887敲低組及對照組細胞于96孔板中，每組設5個復孔，并分別于接種后第1、2、3、4天根據試劑盒說明加入CCK8工作液（工作液配制方法：用RPMI1640完全培養液將CCK8儲存液稀釋10倍），于培養箱中繼續孵育2 h后采用酶標儀讀取細胞培養板中的吸光度值，記錄數據并繪制細胞生長曲線。（7）細胞周期檢測：收集LOC344887敲低組及對照組的細胞各1×105個，加入5 mL PBS清洗細胞2次，之后用預冷的70%乙醇溶液在-20℃冰箱固定細胞過夜。次日設轉速1,500 rpm離心5 min收集細胞沉淀，再加入5 mL PBS清洗細胞2次，之后按照PI/RNase染色液操作說明各組分別加入500μL染色液對細胞進行標記，室溫避光孵育30 min后采用流式細胞儀測定DNA含量，最后運用Modfit軟件擬合數據圖像并分析細胞周期分布。

1.3 統計學方法 采用Prism 8.0統計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用非配對的t檢驗。NSCLC組織與癌旁組織比較采用配對t檢驗。采用Kaplan-Meier繪制生存率曲線，生存曲線比較采用Log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC組織中LOC344887的表達水平 分析ENCORI數據庫中相關資料發現LOC344887在NSCLC樣本中的表達存在整體上調趨勢，尤其是在肺鱗癌樣本中的表達相較正常樣本顯著上調了155.7倍，差異具有統計學意義（P＜0.001），見圖1。以上結果提示LOC344887可能與肺鱗癌發生、發展的相關性更高，于是本研究后續著重研究LOC344887對肺鱗癌細胞的影響。

圖1 NSCLC樣本與非配對的正常樣本中LOC344887的表達水平比較（A.肺腺癌樣本與正常樣本中LOC344887的表達水平比較；B. 肺鱗癌樣本與正常樣本中LOC344887的表達水平比較。與正常樣本比較，***P＜0.01）

2.2 LOC344887敲低組和對照組細胞LOC344887表達水平比較 通過轉染siRNA的方法敲低肺鱗癌細胞NCI-H2170中LOC344887的表達，結果顯示，較對照組，LOC344887敲低組的LOC344887表達下調了約3.2倍，差異具有統計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 LOC344887敲低組和對照組細胞LOC344887表達水平比較（與對照組比較，**P＜0.01）

2.3 敲低LOC344887對NCI-H2170增殖能力的影響 通過克隆形成實驗和細胞生長曲線實驗檢測LOC344887對NCI-H2170細胞增殖的影響，結果顯示敲低LOC344887后，NCI-H2170細胞克隆繁殖能力明顯減弱，生長速率降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 敲低LOC344887對NCI-H2170增殖能力的影響（A.克隆形成實驗；B.細胞生長曲線。與對照組比較，***P＜0.001）

2.4 敲低LOC344887對NCI-H2170細胞周期的影響 流式細胞術檢測細胞周期實驗結果顯示，敲低LOC344887后，NCI-H2170細胞處于S期及G2/M期的細胞比例明顯降低（P＜0.05），處于G1期細胞比例明顯上升，細胞阻滯于G1期，見圖4。

圖4 敲低LOC344887對NCI-H2170細胞周期的影響（A.流式細胞術分析細胞周期分布峰形圖；B.對A圖中各細胞周期分布的統計。與對照組比較，*P＜0.05）

2.5 不同LOC344887表達水平的NSCLC患者總生存期的比較 通過分析TCGA數據庫相關數據繪制的NSCLC患者生存曲線發現，LOC344887表達水平與NSCLC患者的總生存期顯著相關，LOC344887表達越高，患者總生存率越差，提示LOC344887可作為肺鱗癌的潛在治療靶標和預后標志物，見圖5。

圖5 不同LOC344887表達水平的NSCLC患者總生存期的比較

3 討論

近年，大量研究表明lncRNA的異常表達參與調控多種癌癥增殖、凋亡、轉移等過程［5］，lncRNA已逐漸成為了癌癥靶向診斷、治療領域的重要研究對象。在NSCLC中也有相關研究，如lncRNA HOXC-AS3在NSCLC組織及細胞中高表達，其下調可抑制NSCLC細胞的增殖、侵襲、遷移［6］，而lncRNA PCAT1則可通過抑制cGAS/STING信號介導T細胞活化，從而促進NSCLC發生和免疫抑制［7］。因此，探究NSCLC中lncRNA的臨床意義、生物學功能及作用機制，有助于推動NSCLC的診斷和靶向治療。

前期WU等［8］首次發現LOC344887在NSCLC組織中高表達，但該研究并未分析其在不同類型NSCLC組織中的狀態及相關性，也尚未進一步研究其功能及作用機制。本研究首先通過數據庫挖掘發現LOC344887在NSCLC樣本中高表達，進一步分析發現其在肺鱗癌樣本中的異常表達較肺腺癌樣本中的更明顯，推測LOC344887可能與肺鱗癌發生發展的相關性更高。本研究還發現LOC344887在NSCLC組織中表達越高，患者預后越差，提示LOC344887可作為肺鱗癌的潛在治療靶標和預后標志物。

目前有關LOC344887在腫瘤發生、發展中作用機制的研究報道較少。本研究顯示敲低肺鱗癌細胞中LOC344887的表達降低了細胞增殖速率，并阻滯細胞于G1期，提示LOC344887與肺鱗癌細胞的生長密切相關，綜合以上信息作者也初步推測LOC344887表達水平具有組織差異性，在不同腫瘤中呈現不同狀態，作用機制也不同。

另外，有研究提示LOC344887可能受核因子-E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）調控，介導抗癌藥物對結腸癌、食管癌細胞的抗腫瘤作用［9］，調控肺纖維化發生［10］。還有研究表明LOC344887可能通過調控下游靶基因的甲基化介導胃癌進展［11］，說明LOC344887在DNA表觀遺傳調控方面也發揮著重要作用。這為我們后續挖掘LOC344878在NSCLC中的分子機制提供了方向，之后課題組將深入探究LOC344887在不同類型NSCLC中的作用機制，為NSCLC的發生、發展的機制研究提供新見解。

綜上所述，本研究證實了LOC344887影響LUSC細胞NCI-2170的生長，LOC344887在NSCLC組織中高表達且與預后相關。LOC344887可能為肺鱗癌的潛在治療靶點和預后標志物。