正交響應面提取山核桃外果皮4,8-DHT的研究

張金云，劉 姚，楊 光，宋 杰，陽桂芳，吳世軍

（廣東生態工程職業學院 園藝與食品學院，廣東 廣州 51000）

天然產物提取方法主要有超聲法、浸提法、研磨萃取法、熱回流法、微波法和酶解法等[1]。工業化提取天然產物常用浸提法，多采用正交設計，優化時提取工藝條件影響較大的浸提時間、浸提溫度、浸提溶劑和料液比等參數[2]。目前，正交響應面優化超聲提取法在核桃外果皮天然產物提取中的應用還不多見，正交響應面分析法中的中心組合試驗設計模型可以提供3～12個因素，從高到低3個水平的試驗設計與分析。與正交法相比，該方法使用高效、模型誤差小、精度高，通過回歸模型預測試驗結果與實測試驗結果之間有無差異[3，4]。因此，對山核桃外果皮化感活性物質提取條件進行正交響應面設計，對于高效提取4,8-DHT 有一定意義。本文采用正交響應面分析法優化設計山核桃外果皮4,8-DHT 提取條件影響較大的因素，確定山核桃外果皮4,8-DHT 提取工藝的最佳組合，為工業化提取4,8-DHT奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料

4,8-DHT標準品（97.8%）從山核桃外果皮分離純化獲得。

1.2 主要儀器

JP3-120 超聲清洗機（上海一恒科學儀器有限公司）；ESJ-4B 萬分之一電子天平（上海嘉展儀器設備有限公司）；BPMJ-250F恒溫智能培養箱（河南鞏義予華有限公司）。Agilent Technologies 1290 Infinity 超高效液相色譜（UPLC）（美國安捷倫科技公司）；R-210旋轉蒸發儀（瑞士步琪公司）。

2 方法

2.1 標準曲線溶液配置

標準曲線溶液的配置，精確稱取4,8-DHT 樣品5 mg，乙醇定容10 mL，配制成濃度為500 μg/mL 標準母液，將標配母液制成1.25 μg/mL、0.625 μg/mL、0.312 μg/mL、0.156 μg/mL和0.078 μg/mL不同濃度標準溶液。

2.2 4,8-DHT標準曲線R2值

標準曲線樣品吸光值分別為2.073、1.013、0.543、0.266和0.106。y=1.658 1x-0.003（R2=0.999 3）。

2.3 4,8-DHT含量測定方法

將山核桃外果皮水浸提液真空抽濾，濾液減壓旋蒸干燥后通過Diaion HP-20 柱初分離，用不同濃度的乙醇溶液（0、10%、30%、50%和60%）洗脫，并收集洗脫液，洗脫流速25 mL/min，梯度洗脫至洗脫液為無色。合并收集的洗脫液。UV測定吸光值，計算4,8-DHT含量。

2.4 4,8-DHT提取含量計算方法

4,8-DHT提取含量的計算公式為：

式中：T——4,8-DHT 的提取含量，mg/g；C——所測的樣品的的濃度，μg/mL；V——樣品體積，mL；W——山核桃外果皮粉末的質量，g。

3 結果與分析

3.1 山核桃外果皮4,8-DHT單因素提取試驗

不同提取條件對4,8-DHT含量的影響，見圖1。

圖1 不同提取條件對4,8-DHT含量的影響Fig.1 Effects of different extraction conditions on the content of 4,8-DHT

由圖1A 可知，當提取時間為2 h 時提取含量達最高；由圖1B可知，當提取溫度達到70℃時提取含量達峰值；由圖1C可知，當超聲功率為65 W 時提取含量最高；由圖1D 可知，當提取乙醇濃度達到65%時提取含量達峰值，故選取2 h、70℃、65 W、65%為正交響應面提取因素試驗的中間水平值。

3.2 4,8-DHT提取正交響應曲面的優化

3.2.1 山核桃外果皮提取4,8-DHT響應曲面試驗

響應面分析的因素與水平見表1。根據CCD 原理，整個試驗過程以4,8-DHT 提取含量為響應值，以提取時間、溫度、超聲功率和乙醇濃度為因素，設計4 因素3 水平的超聲提取響應面試驗。

表1 響應面分析法的因素與水平表Tab.1 Factor and level table of response surface analysis

3.2.2 超聲提取4,8-DHT的模型和顯著性分析

應用Design-expert（version8.0）軟件對表1 提取試驗數據進行多元回歸擬合，得到4,8-DHT 提取含量（y）的二次多項式回歸方程為：

式中：x1——提取時間真實值，h；x2——提取溫度真實值，℃；x3——提取功率真實值，W；x4——乙醇濃度真實值，%。

Design-expert 對模型進行顯著性分析，結果見表2 可。結果顯示模型P＜0.000 1，表明該模型的回歸方程極顯著；同時模型的線性相關系數（R2）為0.926 5，表明模型可以解釋92.65%的總變異，模型擬合程度較好，總差0.046，系統誤差不大，說明可以用此模型來分析和預測超聲提取4,8-DHT 的含量。

表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance

3.2.3 超聲提取4,8-DHT的響應曲面分析

由圖2A 可知，超聲功率62.5 W、乙醇濃度65%，提取時間和提取溫度對4,8-DHT 提取含量影響試驗結果顯示，當提取時間大于1 h，溫度在55℃～65℃時，4,8-DHT 提取含量高于2.41 mg/g。時間和溫度對4，8-DHT 提取含量影響不顯著（P＜0.05）；時間和溫度的交互作用對4,8-DHT 提取含量影響不顯著（P＞0.05）；由圖2B 可知，時間2 h、提取溫度70℃，超聲功率和乙醇濃度對4,8-DHT 提取含量影響試驗結果顯示，當超聲功率＞50 W、乙醇濃度＞50%時，4,8-DHT 提取含量高于2.43 mg/g。超聲功率和乙醇濃度顯著影響4,8-DHT 提取含量（P＜0.05）；超聲功率和乙醇濃度的交互作用顯著影響4，8-DHT 提取含量（P＜0.05）；由圖2C 可知，當超聲功率＞50 W，提取溫度在55℃～65℃時，4，8-DHT 提取含量高于2.39 mg/g。超聲功率對4,8-DHT 是顯著的；溫度、超聲功率和乙醇濃度的交互作用對4,8-DHT 提取含量影響不顯著（P＞0.05）；由圖2D 可知，當超聲功率＞50 W、提取時間＞1 h 時，4,8-DHT 提取含量高于2.44 mg/g。超聲功率，超聲功率和時間的交互作用對4,8-DHT 提取含量影響顯著；時間對4,8-DHT 提取含量影響不顯著的（P＞0.05）；由圖2E 可知當乙醇濃度＞50%，取溫度在55℃～65℃時，4，8-DHT 提取含量高于2.43 mg/g。乙醇濃度對4,8-DHT 是顯著的；溫度，溫度與乙醇濃度的相互作用對4,8-DHT 的影響是不顯著的（P＞0.05）；由圖2F 可知，當乙醇濃度＞50%、時間＞1 h 時，4,8-DHT提取含量高于2.42 mg/g。乙醇濃度顯著影響4,8-DHT 提取含量；時間與乙醇濃度的相互作用對4,8-DHT 提取含量無影響（P＞0.05）。

圖2 時間、溫度、超聲功率和乙醇濃度對4,8-DHT提取含量響應曲面的影響Fig.2 Effect of time,temperature,ultrasonic power and ethanol concentration on the content response surface of 4,8-DHT extraction

3.2.4 超聲提取4,8-DHT的響應曲面優化與顯著性驗證

模型的驗證，見表3。

表3 模型的驗證Tab.3 Verification of model

由3表可知，提取時間1.04 h，提取溫度60.2℃，超聲功率為52.76 W，乙醇濃度為50%。在此條件下，4,8-DHT 提取含量的理論值為2.48 mg/g；試驗值為2.48 mg/g。結果表明理論值與試驗值相近，模型可用。

4 討論

研究結果表明，4,8-DHT 標準曲線為y=1.658 1x-0.003（R2=0.999 3），4,8-DHT 含量與峰面積線型關系良好，可以用來測定山核桃外果皮4,8-DHT含量。

最佳提取工藝研究結果表明，超聲法不考慮提取因素之間互作對提取含量的影響，當提取時間為2 h、提取溫度為70℃、超聲功率為65 W、乙醇濃度為65%時，4,8-DHT提取效果最好。有研究采用正交熱回流法提取山核桃外果皮中核桃酮，單因素核桃酮最佳提取溶劑為95%的乙醇，溫度為80℃，提取時間為1 h 時，正交試驗熱回流法提取最佳條件為95%乙醇，提取溫度80℃，提取時間1 h[5]。

超聲法與熱回流法提取時間相同，其他因素存在差異，有可能是因為提取物均為水溶性和醇溶性化學物質，熱回流法提取過程中乙醇可以循環利用，在較高溫度情況下，乙醇無蒸發損失。因此，乙醇濃度相對較高，有利于物質的提取。超聲法雖然有利于提高物質溶解速度，但溫度較高時，溶劑乙醇容易蒸發，故而超聲法溫度和乙醇濃度相對回流法要略有降低，且響應面超聲法模型理論值（2.48 mg/g）與實測值（2.49 mg/g）相近，表明最佳提取工藝可用。考慮工藝化提取4,8-DHT 含量過程熱耗損失與乙醇經濟成本，適當的溫度和乙醇濃度有利于降低工業化生產成本。

5 小結

經過試驗驗證得出，超聲提取山核桃外果皮4,8-DHT 的最佳工藝條件為：提取時間1 h，提取溫度60℃，超聲功率55 W，乙醇濃度50%；在該工藝條件下，4,8-DHT 提取含量為2.48 mg/g，達到最優。