非生物脅迫對金龍膽草主要成分積累的影響及隸屬函數分析

高靜雷,楊彩紅,孫 蓉*,劉 姍

(1.攀枝花學院生物與化學工程學院,四川攀枝花 617000;2.攀枝花市林業技術服務中心,四川攀枝花 617000)

《中華人民共和國藥典》記載金龍膽草(ConyzabliniiH.Lév)具有清熱化痰、止咳平喘、解毒利濕、涼血止血作用,可用于治療肺熱咳嗽、痰多氣喘、咽痛等疾病[1]。與大多數中草藥相同,金龍膽草含有豐富的次生代謝物,包括萜類、黃酮類、揮發油及生物堿等,其中皂苷、苦蒿素和黃酮為其主要藥用成分[2]。早期臨床試驗證明金龍膽草皂苷對治療慢性支氣管炎有一定療效且無明顯副作用[3-4]。齊永清等[5]研究表明金龍膽草總皂苷具有促進呼吸道清除異物和抑制咳嗽的作用;此外金龍膽草皂苷對宮頸癌及肺癌細胞具有一定的抑制效果[6-7]。苦蒿素是該草藥的特征化合物,藥典要求金龍膽草干燥品苦蒿素含量不得少于0.30%,研究表明其可明顯地抑制幽門結扎大鼠胃潰瘍的形成[8];金龍膽草中的黃酮類物質主要包括蘆丁、槲皮素、山奈酚、圣草素及它們的衍生物等[3,5,9],具有抗衰老、抗腫瘤、降血脂、抗病毒、止咳等作用。

金龍膽草藥材資源以野外生長為主,由于環境的變化,目前該藥材資源正在日益減少,同時因其栽培周期較長、易受病害侵襲、對生長環境要求高等,難以大規模人工種植,且次生代謝物在原植物中含量偏低,一系列原因致使該藥材的開發利用受限,難以滿足社會需求。提高次生代謝物含量、增加金龍膽草耐受性是改變現狀的重要舉措。外界環境因素(如干旱、低溫、高鹽、外源激素等)可通過激活細胞信號轉導通路,調控轉錄因子,影響關鍵酶基因的表達,從而合成和積累次生代謝產物,增加植物系統抗性,使植物產生脅迫耐受[10]。例如紫外光脅迫后轉MtIFS1基因的苜蓿(Medicagosativa)中出現了一個新的異黃酮化合物[11]。低溫脅迫24 h大豆(Glycinemax)根部總酚酸和異黃酮含量均增加[12]。徐茂軍[13]研究發現在長春花萜類吲哚生物堿的合成過程中,茉莉酸甲酯(MeJA)能夠調節長春花堿的合成,以提高其含量。該研究通過紫外、干旱、高鹽、低溫和外源茉莉酸甲酯脅迫金龍膽草,檢測皂苷、苦蒿素和黃酮含量的變化,探討提高金龍膽草次生代謝物含量的有效手段,為培育高含量、高脅迫耐受金龍膽草植株提供基礎材料,也為金龍膽草藥物的應用提供資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料金龍膽草植株2020年夏通過種子盆栽于攀枝花學院溫室,經四川農業大學生命科學學院陳惠教授鑒定為金龍膽草(ConyzabliniiH.Lév)。待植株長至蕾薹期后將其分為5組,每組9盆進行脅迫試驗,在上、中、下部位各隨機選取葉片進行含量測定。

1.2 試驗方法

1.2.1鹽脅迫處理。取長勢一致蕾薹期金龍膽草植株進行鹽脅迫試驗,鹽脅迫濃度為200 mmol/L,鹽脅迫時間為0(CK)、24和48 h,培養溫度為室溫,光照為正常日光,每個次生代謝物組設置3個生物學重復。處理0、24和48 h分別取一次樣,取樣時間在09:00—10:00。取完每個樣品后在60 ℃恒溫烘干至恒重,研磨成粉保存,用于次生代謝物含量的測定。

1.2.2低溫脅迫處理。低溫脅迫試驗脅迫溫度為4 ℃,脅迫時間為0 (CK)、24和48 h,光照為正常日光,正常澆水,每個次生代謝物組設置3個生物學重復。處理0、24和48 h分別取一次樣,取樣時間在09:00—10:00。取完每個樣品后在60 ℃恒溫烘干至恒重,研磨成粉保存,用于次生代謝物含量的測定。

1.2.3干旱脅迫處理。采用盆栽控水法,自然干旱的方式進行干旱脅迫處理,在處理前,所有材料均充分灌溉,并采樣作為對照(0 d),之后分別在10和15 d取一次樣,培養溫度為室溫,光照為正常日光,每個次生代謝物組設置3個生物學重復。取樣時間在09:00—10:00。取完每個樣品后在60 ℃恒溫烘干至恒重,研磨成粉保存,用于次生代謝物含量的測定。

1.2.4紫外脅迫處理。將試驗材料放置于垂直距離為45 cm的40 W紫外燈下,脅迫時間為0(CK)、24和48 h,培養溫度為室溫,正常澆水,每個次生代謝物組設置3個生物學重復。取樣時間在09:00—10:00。取完每個樣品后在60 ℃恒溫烘干至恒重,研磨成粉保存,用于次生代謝物含量的測定。

1.2.5茉莉酸甲酯處理。用100 μmol/L茉莉酸甲酯-0.25%乙醇溶液每隔2 h噴施葉面一次,分別于噴施前0 h(CK)和噴施后24、48 h取樣,培養溫度為室溫,光照為正常日光,每個次生代謝物組設置3個生物學重復。取樣時間在09:00—10:00。取完每個樣品后在60 ℃恒溫烘干至恒重,研磨成粉保存,用于次生代謝物含量的測定。

1.3 含量測定方法

1.3.1皂苷含量測定。采用乙醇超聲提取法提取皂苷,取樣品粉末0.1 g加入10 mL 70%乙醇,密封,70 ℃,40 kHz超聲波提取40 min,提取后的溶液12 000 r/min離心5 min,取上清于干凈試管中,在烘箱揮干至恒重,加入0.3 mL 5%香草醛溶液(用冰醋酸配制)、0.8 mL高氯酸,65 ℃水浴25 min,取出用冷水終止反應,隨即加入5 mL冰醋酸,搖勻備用,在544 nm 處測定吸光度,按公式(1)計算含量。

(1)

式中:c為標準曲線計算的儀器檢測濃度(mg/mL);V1為提取液定容量(mL);V2為測定時定容量(mL);M為稱取藥材量(g)。

取3 mg齊墩果酸用70%乙醇定容至10 mL,分別取0、100、200、300、400、500 μL溶液,通過上述方法測定吸光度,繪制標準曲線。

1.3.2苦蒿素含量測定。采用甲醇浸提法提取苦蒿素,取樣品粉末0.1 g加入4 mL甲醇37 ℃浸提過夜,12 000 r/min離心10 min,取上清液,利用0.22 μm有機相濾頭過濾,將濾液裝入液相樣品瓶中,通過高效液相色譜法(HPLC)檢測苦蒿素含量。

HPLC條件:以安捷倫C18柱(150 mm×4.5 mm×5 μm)為色譜柱,柱溫25 ℃,流動相為甲醇∶水∶乙腈=40∶45∶5,進樣量為10 μL,流速為1 mL/min,檢測波長為210 nm。標準品濃度為12.5、25.0、50.0、75.0、100.0 mg/L。

1.3.3黃酮含量測定。采用乙醇超聲提取法提取黃酮,取樣品粉末0.1 g加入3 mL 65%乙醇,密封,70 ℃,40 kHz超聲波提取30 min,抽濾取濾液。再在濾渣中加入3 mL 65%乙醇,重復上述操作,合并濾液。加入6 mL石油醚過夜浸提,使用分液漏斗分離并收集下層液體,通過0.45 μm有機相濾頭過濾,取濾液進行含量測定。取1 mL濾液于25 mL燒杯中,依次加入0.5 mL 5% NaNO2,放置6 min;加入0.5 mL 10% Al(NO)3,放置6 min;加入4 mL 10% NaOH溶液,最后用65%乙醇定容至10 mL,室溫下反應15 min。在510 nm處測定吸光度,按公式(2)計算含量。

(2)

式中:c為標準曲線計算的儀器檢測濃度(mg/mL);V1為提取液定容量(mL);V2為測定時定容量(mL);V3為吸取測定量(mL);M為稱取藥材量(g)。

取25 mg蘆丁用65%乙醇定容至25 mL,分別取0、200、400、600、800、1 000 μL溶液,通過上述方法測定吸光度,繪制標準曲線。

1.4 數據分析采用隸屬函數法對不同非生物脅迫處理進行綜合評價,獲得最優處理方式。計算公式如下:

隸屬函數值:

U(Xij)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(3)

反隸屬函數值:

U(Xij)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(4)

式中:U(Xij)為i處理j代謝物含量的隸屬函數值;Xij為i處理j代謝物含量的測定值;Xmin、Xmax為所有處理中某一代謝物含量的最小值和最大值。

2 結果與分析

2.1 不同脅迫對金龍膽草皂苷含量的影響從圖1可以看出,經過不同脅迫處理后金龍膽草皂苷含量均呈上升趨勢,其中紫外脅迫后含量上升最明顯,在脅迫24 h是對照(CK)的1.36倍,48 h是CK的2.06倍。其次為低溫脅迫,脅迫24和48 h皂苷含量分別為CK的1.34和2.05倍。再者為茉莉酸甲酯處理,脅迫24和48 h皂苷含量分別為CK的1.29和1.69倍。干旱脅迫和高鹽脅迫作用不明顯,干旱處理10 d皂苷含量增加了1.18倍,15 d增加了1.21倍,而高鹽處理24 h是CK的1.05倍,48 h是CK的1.34倍。因此不同處理對金龍膽草皂苷含量的影響從大到小依次為紫外>低溫>茉莉酸甲酯>高鹽>干旱。

注:不同小寫字母表示同一處理不同時間之間差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同脅迫對金龍膽草苦蒿素含量的影響從圖2可以看出,對苦蒿素含量影響最大的處理也為紫外脅迫,與CK相比,脅迫24 h苦蒿素含量增加了0.23倍,48 h增加了0.43倍。其次為高鹽脅迫,脅迫24 h苦蒿素含量增加了0.04倍,48 h增加了0.27倍。低溫脅迫與高鹽脅迫對苦蒿素含量的影響相差不大,脅迫48 h苦蒿素含量增加了0.26倍。再者為茉莉酸甲酯處理,與CK相比,處理24 h苦蒿素含量增加了0.11倍,48 h增加了0.19倍。影響最小的脅迫為干旱,干旱脅迫10 d苦蒿素含量僅增加了0.03倍,15 d增加了0.06倍。因此不同處理對金龍膽草苦蒿素含量的影響從大到小依次為紫外>高鹽>低溫>茉莉酸甲酯>干旱。

注:不同小寫字母表示同一處理不同時間之間差異顯著(P<0.05)。

2.3 不同脅迫對金龍膽草黃酮含量的影響從圖3可以看出,各非生物脅迫對黃酮含量的影響均呈升高趨勢,其中茉莉酸甲酯處理作用最明顯,處理24 h黃酮含量增加了2.95倍,48 h增加了3.68倍。干旱脅迫10 d黃酮含量增加了1.04倍,15 d增加了3.33倍。低溫脅迫僅次于干旱脅迫,脅迫48 h金龍膽草黃酮含量增加了3.02倍。高鹽和紫外脅迫對黃酮含量的影響較小,脅迫24 h黃酮含量分別增加了1.27和1.21倍,48 h黃酮含量分別增加了1.33和1.85倍。因此不同處理對金龍膽草黃酮含量的影響從大到小依次為茉莉酸甲酯>干旱>低溫>紫外>高鹽。

注:不同小寫字母表示同一處理不同時間之間差異顯著(P<0.05)。

2.4 不同非生物脅迫下金龍膽草主要化合物含量隸屬函數分析選擇各脅迫處理48 h/15 d的次生代謝物含量數據,利用模糊隸屬函數,計算各脅迫綜合隸屬值。根據隸屬函數平均值的大小確定最優脅迫方式。由表1可知,各脅迫處理的效果由強到弱依次為紫外>茉莉酸甲酯>低溫>高鹽>干旱。

表1 不同非生物脅迫下次生代謝物含量隸屬函數值

3 結論與討論

研究表明藥用植物的藥理作用主要與次生代謝物有關,且當其受到環境脅迫時可通過積累次生代謝物提高自我保護和生存競爭能力。因此研究其與環境的關系,對藥用植株栽培過程中控制有關成分的合成和積累具有指導意義。皂苷、苦蒿素、黃酮為藥用植物金龍膽草的主要有效成分,提高它們的含量可獲得高品質的金龍膽草藥材。次生代謝物的積累需要環境因子的誘導,可誘導或影響次生代謝產物合成積累的環境因子很多,例如個體密度和病蟲害的侵襲等生物因子,以及水分、溫度、紫外線、外源激素、土壤理化性質等非生物因子[14-15]。各類非生物因子通過激活信號分子,誘導轉錄因子轉錄,從而促進一系列關鍵酶基因的表達,最終調節次生代謝物的合成。

基于此,該研究探討了鹽脅迫、低溫脅迫、干旱脅迫、紫外脅迫及外源激素誘導對皂苷、苦蒿素、黃酮含量的影響,結果發現在各類脅迫下,3種次生代謝物含量均呈增加趨勢。其中紫外脅迫對金龍膽草皂苷和苦蒿素的作用最大,兩者皆為萜類衍生物。Zhan等[16]研究表明,在紫外脅迫下金龍膽草抗氧化能力提高,同時部分轉運蛋白基因表現為上調,這些條件有利于苦蒿素的積累。黨悅方[17]研究UV-B輻射對夏枯草成分含量的影響,結果表明,UV-B對齊墩果酸和熊果酸的含量均有促進作用。該研究表明對黃酮含量影響最明顯的是茉莉酸甲酯處理,雒曉鵬等[18]和王旭云等[19]均研究發現茉莉酸甲酯對植物黃酮含量有明顯促進作用。

綜上所述,非生物脅迫對金龍膽草次生代謝物含量有促進作用,可以利用適當的脅迫手段獲得高次生代謝物含量的金龍膽草植株,為高品質金龍膽草的培育提供一定的參考,對金龍膽草藥物的開發具有促進作用。在此基礎上,未來可對其脅迫響應機制進一步研究,獲得關鍵轉錄因子和酶基因,調控次生代謝物的合成。