豬糞堆肥復合菌劑培養條件優化及其對好氧堆肥的影響

王 聰,冀紅柳,尹 苗,易浩楠,張莉萍,鄧永濤,陳希文*

(1.綿陽師范學院動物疫病防控與健康養殖工程技術研究中心,四川綿陽 621000;2.四川生豬重大疫病監測與防控工程研究中心,四川綿陽 621000)

隨著生活質量的提高,畜禽養殖業在我國得到了快速發展,畜牧經濟增長迅速[1]。然而,隨著畜禽養殖規模化程度的不斷提高,畜禽糞尿排泄物集中產生、亂堆亂放,使得畜禽養殖帶來的環境污染問題日益嚴重[2-3]。據統計,我國每年畜禽糞污產生量高達38億t,但綜合利用率卻不足60%[4]。然而,畜禽中含有豐富的有機質和營養元素,可以進行堆肥處理,使其成為可用資源[5]。隨著現代生物技術的快速發展及高效化應用,添加微生物菌劑已成為堆肥發酵中的常用手段[6]。添加微生物菌劑可調節堆體微生物群落結構,縮短發酵時間[7],迅速有效分解纖維素等有機物質[8],提高堆肥產品的肥效[9-11],減少惡臭氣體的排放[12],對改善生態環境、實現資源循環利用具有重要意義[13]。響應面優化分析法作為一種試驗次數少、周期短,求得的回歸方程精度高,能研究幾種因素間交互作用的回歸分析,則常用于菌劑的條件優化[14],進而使復合菌劑的活菌數達到最優,為復合菌劑的擴大培養和開發提供技術支持。筆者將復合菌劑應用于實際豬糞好氧堆肥過程,探究自制復合菌劑的可行性,以期為生物發酵堆肥應用研究提供理論基礎與參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料新鮮豬糞收集于四川鐵騎力士養殖場;玉米芯由綿陽師范學院人工氣候室提供;堆肥樣品來自四川鐵騎力士公司;凋落物來自學校凋落物、野外凋落物;廚余垃圾周圍土壤取自學校食堂垃圾堆周邊。堆肥原料基本信息見表1。

表1 堆肥原料基本信息

纖維素降解菌篩選培養基:羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)2.00 g,NaCl 5.00 g,K2HPO41.00 g, MgSO4·3H2O 0.50 g,NaNO33.00 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂20.00 g,去離子水1 000 mL。淀粉降解菌篩選培養基:蛋白胨10.00 g、牛肉膏5.00 g、NaCl 5.00 g、可溶性淀粉20.00 g、瓊脂粉15.00 g,水1 000 mL,pH 7.0。油脂降解菌篩選培養基:蛋白胨10.00 g,酵母膏5.00 g,羅丹明B 0.01 g,NaCl 10.00 g,MgSO4·7H2O 1.00 g,K2HPO40.50 g,KH2PO40.50 g,瓊脂粉15.00 g,菜籽油12.00 mL,去離子水1 000 mL,pH 7.2～7.4。纖維素降解菌產酶培養基:CMC-Na 10.00 g,蛋白胨2.00 g,酵母提取物2.00 g,蒸餾水1 000 mL,自然pH。淀粉降解菌產酶培養基:蛋白胨10.00 g、牛肉膏5.00 g、NaCl 5.00 g、可溶性淀粉20.00 g、瓊脂粉15.00 g,水1 000 mL,pH 7.0。油脂降解菌產酶培養基:蛋白胨10.00 g,酵母膏5.00 g,羅丹明B 0.01 g,NaCl 10.00 g,MgSO4·7H2O 1.00 g,K2HPO40.50 g,KH2PO40.50 g,菜籽油12 mL,去離子水1 000 mL,pH 7.2～7.4。種子培養基:葡萄糖5.00 g,酵母粉5.00 g,K2HPO41.00 g,NaCl 5.00 g,蒸餾水1 000 mL,pH自然。

1.2 方法

1.2.1菌種的篩選。從新鮮豬糞、堆肥樣品、凋落物、廚余垃圾周圍土壤中篩選菌種,接種于纖維素、淀粉、油脂培養基上,分別選出對纖維素、淀粉、油脂降解率高的菌種,將其分別命名為XWS、DF、YZ。對各菌株進行拮抗試驗,選擇相互無拮抗作用的菌株用于堆肥復合菌劑的制備。

1.2.2復合菌劑單因素條件優化。進行單因素試驗[15]前,為了確保試驗的準確性,對初始菌液濃度進行統一。在滅菌后的LB培養液中接入由1∶1∶1復合而成的微生物菌液,在37 ℃ 180 r/min條件下培養18 h。在OD600調零的分光光度計下,以未接種菌液的LB培養液作為對照,在空比色皿中加入不同體積的混合菌液和LB培養液,直至OD值為1.0后依據這個比值,在新的已滅菌的錐形瓶中進行混合,并重新測定錐形瓶中混合液的OD600,再次根據重新測定的OD600微調至OD值為1.0為止。之后每次相關試驗所需初始菌液濃度均為以上測得數值。然后考慮不同碳源、氮源組合及其添加量,改變不同初始pH、溫度、菌液添加量、不同轉速,探究每個因素的最優條件,以培養出最優菌劑。

1.2.3復合菌劑Plackett-Burman試驗設計。根據單因素試驗得出每個因素的最適范圍,將每個因素的高低2水平輸入Plackett-Burman試驗設計[16],對試驗的高低水平進行編碼,然后生成相應的試驗設計表格,將試驗數據再次填入試驗設計表格進行分析,從而得到對試驗影響顯著的因素。

1.2.4復合菌劑Box-Behnken試驗設計。根據Plackett-Burman試驗設計結果對復合菌劑進行Box-Behnken試驗設計[17],然后通過生成的試驗表格進行試驗,進而對試驗結果進行數據分析,隨后獲得相應的回歸方程,最后通過該方程得到最佳的活菌數生長條件。

1.2.5堆肥體系構建與取樣、指標測定。將玉米芯與豬糞充分混合,置于泡沫箱中。對照空白組:豬糞+玉米芯,不添加任何外源菌劑;處理組:豬糞+玉米芯,添加自制外源菌劑。

為確保堆肥的成功率,以溫度變化為依據進行適當的翻堆處理。溫度每天記錄,每進入一個堆肥階段進行一次樣品采集,每次采樣取上、下、左、右、中5個方位,及對應位置的上、中、下3層進行采樣,采樣四分法分取樣品,共采集300 g左右即可。將采集的樣品分成2部分,一部分經研磨后過100目尼龍篩,用于后續各項指標的檢測試驗,另一部分保存。

堆體的總碳、總氮及pH根據《肥料合理使用準則有機肥料》進行測定;含水率以及蚊、蠅密度氣味等感官評價參考GB 7959—2012標準測定;種子發芽率計算按NY/T 3442—2019的規定執行;采用失重法測定纖維素降解率,采用分光光度法測定淀粉降解率,采用分光光度法測定油脂降解率[18]。

2 結果與分析

2.1 菌種的篩選

2.1.1初篩。從新鮮豬糞等材料中篩得纖維素降解菌22株,淀粉降解菌18株,油脂降解菌23株,共63株。

2.1.2復篩。由于堆肥過程中升溫,對菌株的篩選需考慮升溫后的酶活性、降解性能。對比37 ℃與55 ℃下各種菌的性能,22株纖維素降解菌在37 ℃均有降解效果,但溫度升到55 ℃后僅有如圖1a所示的6株,XWS-3、XWS-8、XWS-9、XWS-12、XWS-19酶活大大降低,波動幅度過大,產酶性狀不穩定。菌株XWS-22產酶性能較37 ℃時稍下降,其波動在可接受范圍內,因此,選擇菌株XWS-22作為復合菌劑的目標菌株。

注:a.纖維素降解菌酶活;b.淀粉降解菌酶活;c.油脂降解菌酶活。

在37 ℃培養條件下,18株淀粉降解菌均能產生水解透明圈。溫度升至55 ℃時,僅有DF-6、DF-9、DF-11產生水解透明圈,菌株DF-11在2種溫度下酶活差異較小,且較為穩定,因此選擇DF-11作為制備復合菌劑的目標菌株。

在37 ℃培養條件下,23株油脂降解菌均可產生水解圈。當55 ℃時,僅剩YZ-5、YZ-12、YZ-14、YZ-17、YZ-19、YZ-22、YZ-23這7株菌可以產生透明圈,在37、55 ℃條件下,YZ-23菌株酶活差異小,且效果比較好,因此選擇該菌作為復合菌劑的目標菌株。

經鑒定菌株XWS-22為海洋芽孢桿菌,菌株DF-11為巨大芽孢桿菌,菌株YZ-23為枯草芽孢桿菌。

2.1.3拮抗試驗。將所得3株菌進行拮抗試驗觀察,經試驗確定3株菌之間無明顯拮抗作用(圖2),菌株間不會相互抑制生長,可用于復合菌劑制備。

圖2 3株菌拮抗試驗

2.2 單因素試驗結果

2.2.1碳源、氮源。不同碳源、氮源組合下的有效活菌數見表2、3,淀粉+葡萄糖碳源組合、酵母粉+尿素氮源組合培養的有效活菌數最多,分別為3.9×109、2.4×109CFU/g。由圖3可知,碳、氮源添加量分別在7和9 g/L時,有效活菌數最高,選擇7～9 g/L的碳、氮源添加。但考慮到葡萄糖的影響,對淀粉和葡萄糖分別進行考慮,考慮范圍為3.5～4.5 g/L。

圖3 不同碳源和氮源添加量下有效活菌數

表2 不同碳源有效活菌數

表3 不同氮源有效活菌數

2.2.2初始pH。不同pH下的有效活菌數如圖4所示,pH在7.0～8.0有效活菌數不斷增加,達到8.0后,有效活菌數開始下降。

圖4 不同初始pH下有效活菌數

2.2.3不同溫度、接種量、轉速下的有效活菌數。由圖5～7可知,隨著溫度的不斷升高,有效活菌數也隨之升高,在37 ℃時,有效活菌數開始降低,最適溫度為30～37 ℃。隨著接種量的不斷增加,在接種到7%時,有效活菌數達到最大值,因此選擇7%～8%作為下一步試驗基礎。轉速在180 r/min的條件下,有效活菌數最高,因此選擇170～190 r/min。

圖5 不同溫度下有效活菌數

圖6 不同接種量下有效活菌數

圖7 不同轉速下有效活菌數

2.3 Plackett-Burman試驗微生物生長發酵所需培養基的成分優化及工藝參數涉及的范圍廣泛,傳統的試驗設計效率相對較低,根據單因素試驗結果,以表4的7個因素為影響因素,利用Plackett-Burman試驗設計,選出有顯著影響的因素,并進行線性回歸分析,回歸方程結果分析見表5。

表4 復合菌劑Plackett-Burman試驗設計

表5 Plackett-Burman 試驗回歸分析

根據Plackett-Burman試驗設計得到回歸方程為:

有效活菌數=5.130+0.035A+0.167B+0.237C-0.400D-0.075E+0.003E+0.003F+0.143G

模型的F值為18.963,P<0.05說明根據試驗設計獲得的回歸方程模型有意義且較為顯著。PredictedR2為0.737,AdjustedR2為0.920,兩者之差小于0.2,也證明該模型有意義且相關性好。AdjustedR2為0.920,表明有92%的預測試驗結果的變異性,可以使用該模型進行解釋。根據P<0.05時,試驗因素對試驗結果有顯著影響為依據可判定出葡萄糖、氮源添加量、pH和接種量對試驗有顯著影響。

2.4 Box-Behnken試驗Box-Behnken試驗分析所得回歸方程為:

有效活菌數=5.494+0.116A-0.045B+0.238C+0.185D+0.038AB+0.088AC+0.038AD-0.060BC+0.018BD+0.050CD-0.427A2-0.184B2+0.255C2-0.009D2

由表6中試驗分析結果可得模型的P<0.05,失擬項的P>0.05,表明該試驗模型所得到的回歸方程是顯著的,具有較為良好的擬合性;R2為0.945,證明該模型可以解釋超過94%的試驗結果,具有良好的相關性;AdjustedR2為0.889,PredictedR2為0.704,兩者相差<0.200,證明該試驗具有較為良好的相關性;通過這些試驗系數的分析,綜合可以得出該試驗的結果與軟件得出的模型具有較為合適的匹配度,各因素之間相互影響效果如圖8所示。

注:a.pH與氮源添加量交互作用的等高線、響應面;b.pH與接種量交互作用的等高線、響應面;c.pH與葡萄糖添加量交互作用的等高線、響應面;d.氮源添加量與接種量交互作用的等高線、響應面;e.氮源添加量與葡萄糖添加量交互作用的等高線、響應面;f.接種量與葡萄糖添加量交互作用的等高線、響應面。

表6 Box-Behnken試驗回歸分析

據以上試驗所得到的回歸方程,以有效活菌數為響應值,當需要得到最大值時,最佳試驗條件為pH為7.44,氮源添加量為7.825 g/L,接種量為7.999%,葡萄糖添加量為4.499 g/L,有效活菌數達到6.186×109CFU/g。根據實際情況,pH為7.4,氮源添加量為7.8 g/L,接種量為8%,葡萄糖為4.5 g/L,經試驗驗證得到平均有效活菌數為6.090×109CFU/g,驗證試驗擬合性良好。

2.5 堆肥指標測定

2.5.1溫度。豬糞好氧堆肥堆制過程中溫度變化如圖9所示,堆體均不同程度經歷升溫期、高溫期及降溫期3個階段的變化。高溫期自制菌劑達到的最高溫度61.5 ℃,高于空白對照組(55.5 ℃),且高溫期延長了2 d。堆肥完成的判定標準為堆體溫度與室溫持平,自制菌劑組共堆制了20 d,空白對照組堆制了29 d。

圖9 好氧堆肥堆制過程中溫度的變化

2.5.2C/N。2組堆肥在整個堆制腐熟過程中C/N均呈現下降狀態,如圖10所示,自制菌劑及空白組的堆肥終產物的C/N分別為9.93、21.37,添加自制菌劑的組對碳氮的利用率更高。

圖10 好氧堆肥堆制過程中C/N的變化

2.5.3含水率。如圖11所示,2組試驗含水率的降低主要發生在高溫期階段,該階段微生物的代謝作用旺盛,水分蒸騰強烈,含水率降低明顯。整個過程中自制菌劑組的含水率均低于空白對照,堆肥最終產品含水率分別為35.69%、22.25%。

圖11 好氧堆肥堆制過程中含水率的變化

2.5.4pH。從圖12可見,2組堆體pH的變化均呈現先升高后降低最后趨于穩定的趨勢,且變化幅度都不大,堆體基本都維持在偏堿性的狀態,終產物pH稍微上升。

圖12 好氧堆肥堆制過程中pH的變化

2.5.5種子發芽率。自制菌劑、空白對照組的種子發芽率分別為91%和86%,自制菌劑組的種子發芽率高于空白對照組。2組的發芽情況見圖13。

圖13 各組堆肥產物種子發芽情況

2.5.6感官評價。發酵升溫期,堆體均吸引蚊蠅,表面和較深層有蟲卵,氣味刺鼻,異味擴散范圍大;進入高溫期后,蚊蠅量和蟲卵均減少,隨著溫度升高,異味逐漸減少,異味范圍縮小;腐熟期,蚊和蟲卵基本消失,氣味消失;堆肥結束后,無蚊蠅和蟲卵,氣味變為腐殖質的清香。加入自制菌劑的堆體,蚊蠅及蟲卵消失的時間比空白對照快。

2.5.7纖維素、淀粉及油脂降解率。空白對照的纖維素、淀粉、油脂的降解率在堆肥過程中均為最低,堆肥產品分別有47.85%的纖維素降解率,48.12%的淀粉降解率,44.01%的油脂降解率。自制菌劑的堆肥產品纖維素降解率可達到64.79%,淀粉降解率高達73.89%,油脂降解率為56.42%(圖14)。

3 討論

3.1 菌種的篩選該研究試驗針對性地從不同的環境中采集樣品,從中分離初篩得到63株菌,由于堆肥過程中溫度會隨著微生物的生長繁殖不斷升高,進而考慮到溫度作用,經過高溫條件下的復篩及常溫和高溫2個階段的酶活比較,最終篩選到XWS-22、DF-11、YZ-23 3株菌,分別為纖維素降解菌、淀粉降解菌和油脂降解菌。XWS-22酶活在37 ℃和55 ℃條件下分別為(48.32±1.22)、(32.78±0.23) U/mL;DF-11的酶活在37 ℃為(31.56±0.67) U/mL,55 ℃條件下為(30.41±1.07) U/mL,XWS-22和DF-11的酶活在高溫下比常溫下均不同程度的下降,XWS-22的酶活下降較多,而DF-11酶活對溫度敏感程度不高;YZ-23的酶活在37 ℃條件下為(30.36±1.23) U/mL,55 ℃為(31.28±1.03) U/mL,YZ-23在高溫情況下酶活更高一些,該菌株對溫度敏感程度不高,甚至可能更適合高溫環境。堆肥過程中有明顯的溫度變化,微生物產酶活性的高低對于有關物質的分解有顯著影響,敖靜等[19]在雞糞堆肥中發現纖維素酶與總菌數呈現正相關,而細菌總數又受到溫度的影響。因此,篩選對于溫度變化影響酶活較為穩定的菌株對復合菌劑的配制是有必要的,并且總菌數對于整體酶活也有一定程度的影響,該試驗在下一步配制復合菌劑應以有效菌活數作為評價指標。

經鑒定,菌株XWS-22、DF-11、YZ-23分別為海洋芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌,這3株菌均無致病性與毒性,一定程度上還能抑制土壤中其他生物毒素的產生,促進植株生長[20-21];經拮抗試驗驗證XWS-22、DF-11、YZ-23 3株菌無明顯拮抗作用,可用于復合菌劑的制備。

3.2 復合菌劑的培養條件優化按照1∶1∶1混合后的菌劑在發酵中會受培養液中不同因素的影響,碳源、氮源的種類及添加量、發酵溫度、初始的pH、轉速等多種因素都會對菌種的生長繁殖產生影響。單因素優化試驗可初步確定復合菌劑的較適范圍,王渝昆等[22]通過對產甲烷復合菌劑進行單因素優化試驗,確定了最適pH和添加量,為下一步試驗提供了理論支撐。張晨敏[23]在秸稈還田的復合菌劑研制中,采用單因素試驗確定大致范圍,為正交試驗提供了數據基礎。該試驗選取對菌種發酵影響較大的因素,并通過單因素試驗確定這些影響因素相對較適的添加組合和范圍。其中,較為關注碳源的選擇,該試驗中3株菌所針對的降解物質不同,因此對碳源的需求也不盡相同。根據試驗發現在整個過程中,復合菌劑對葡萄糖作為碳源更為敏感,生長更好,而淀粉+葡萄糖的組合會比單一葡萄糖的效果更好,可能是該株淀粉降解菌對淀粉的利用級高于對葡萄糖的利用級,也可能是3株菌對淀粉均有降解效果。

通過單因素優化試驗得到影響因素的較優選擇范圍,在該基礎上進行Plackett-Burman試驗設計,以期選擇這些影響因素中對復合菌劑菌種培養更為顯著的影響因子,為條件的進一步優化提供試驗基礎。結合單因素試驗的分析結果,淀粉對復合菌劑的發酵影響程度不大,分析可能是由于隨著葡萄糖的降解,淀粉在生長后期會作為更優質的碳源;溫度選擇在30～37 ℃,對有效活菌數的增加意義不大,分析可能由于芽孢桿菌自身抗逆性的特點,以及在前期進行篩選時已篩選剔除掉對溫度變化敏感的菌株,因此在這個范圍內的波動對于這3株芽孢桿菌來說基本無影響;轉速在菌種培養中的影響與氧氣有關,轉速高可帶來較高的含氧量,該試驗隨著轉速達到170～190 r/min,在其他因素的共同作用下,轉速的P值遠大于0.05,說明對菌種有效活菌數的增加影響不顯著。

在根據PB試驗得到影響最為顯著的4個因素的基礎上進行 Box-Behnken試驗設計,得到最優培養條件,然后進行了4因素3水平響應面優化試驗。通過響應面優化得到最適培養條件是可靠的,為不同菌株組成的復合菌劑優化活菌數提供了理論基礎,也為工業化提供了技術支持。

3.3 復合菌劑對堆肥的影響將優化后的復合菌劑進行實際豬糞堆肥應用,驗證其堆肥效果,其中測定了堆肥溫度、C/N、含水率、pH、種子發芽率等,以驗證堆肥的腐熟程度以及對纖維素、淀粉和油脂的降解率,從而評定菌劑對各項指標的降解率。

將前期篩選得到的3株菌經發酵優化后應用于實際堆肥試驗中,通過設置自制菌劑組和空白對照組進行對照試驗,驗證自制菌劑的應用與實際堆肥試驗的可行性。通過試驗可知,添加自制菌劑比空白對照組快50%,同時對堆體利用率也更好。這有力地驗證了添加外源菌劑的優勢性。張丹等[24]利用微生物資源庫構建的CM菌劑,堆肥的最高溫度可以達到63.5 ℃,高溫期可以達到12 d,提高對垃圾降解率的同時延長了高溫期,有助于病原微生物及蟲卵等的殺滅。2組堆肥在整個堆制腐熟過程中C/N均呈下降狀態,自制菌劑以及空白組的堆肥終產物的C/N分別為9.93、21.37,明顯看出加入菌劑組對碳氮的利用率更高,表明外源菌劑的添加有利于堆肥過程中的物質轉化,在加快對總體有機碳利用的同時相對有機氮損失少,這與王芳等[25]研究一致。堆肥pH均在7.3～8.4,滿足堆肥微生物的pH環境要求,整個過程pH先升高后降低,后期一定程度升高,終產物均呈弱堿性,這與高鵬等[26]研究一致。堆肥初期含水率60%左右,堆肥產品中空白對照組35.69%,添加復合菌劑組含水率僅有22.25%,添加復合菌劑明顯加快微生物代謝,促進了堆肥含水率的下降,這與李再興等[27]研究一致。種子發芽率達到80%以上,說明堆體的腐熟程度符合標準。該研究中自制菌劑組的發芽率比空白組提升了5百分點,表明添加外源菌劑能提高堆肥發芽率,這與高鵬等[26]研究一致。徐杰等[8]利用多重篩選的方法,從各種環境中篩選出4株高效纖維素降解菌,提高了18.86%的纖維素降解率同時減少了NH3高于42%損失率,在轉化纖維素的同時達到了固氮的作用。該研究針對性地對纖維素、淀粉、油脂降解菌株進行篩選,有助于提高降解率。

4 結論

(1)從不同樣品中篩選出XWS-22、DF-11、YZ-23 3株菌,分別為海洋芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌,且彼此間無拮抗作用,無致病性與毒性,可用于復合菌劑制備。

(2)為使復合菌劑的效果達到最佳,以有效活菌數作為響應值進行響應面優化,根據單因素試驗結果,通過 PB 試驗設計得到影響最顯著的4個因素,分別為葡萄糖添加量、氮源添加量、pH、接種量。通過BBD試驗設計得到最佳培養條件為 pH 為7.4,氮源添加量為7.8 g/L,接種量為8%,葡萄糖添加量為4.5 g/L,經試驗驗證得到平均有效活菌數為6.090×109CFU/g,驗證試驗擬合性良好。

(3)將優化后的菌劑進行實際豬糞堆肥試驗,發現由3株菌株復合而成的復合菌劑可以加快豬糞好氧堆肥的進程,延長堆肥高溫期的時間,綜合來講提高了堆肥產品的品質,在豬糞堆肥的無害化和資源化方面具有一定的應用潛能。