CRISPR-Cas12a在病原檢測中的應用進展

王 亮，宋 毅，苗立中，撒瑞雪，常維山

（1.山東省淄博市博山區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 淄博 255000；2.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊；3. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州；4.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東 泰安）

在自然環(huán)境中，許多微生物和寄生蟲病原可引起嚴重疾病，威脅人畜的生命健康，造成重大經(jīng)濟損失，因此對病原的早期快速診斷尤為重要。在分子生物學中，聚合酶鏈式反應（PCR）是分子診斷的最佳選擇，其利用DNA高溫變性、低溫復性和聚合酶在最適溫度下延伸來實現(xiàn)擴增，然而，該方法需要專業(yè)人員、昂貴儀器和實驗室環(huán)境，且耗時較長，限制了其在現(xiàn)場的應用。近年來，依賴于等溫核酸擴增技術(shù)的快速檢測方法也已引起了人們越來越多的關(guān)注，常見的等溫擴增技術(shù)包括環(huán)介導等溫擴增（LAMP）、重組酶聚合酶擴增（RPA）、重組酶介導等溫擴增（RAA）等。隨著對Cas研究的不斷深入，研究人員試圖將Cas作為生物傳感器與核酸擴增技術(shù)相結(jié)合，推出簡單、快速、適合現(xiàn)場檢測的病原檢測方法[1-3]。RAA技術(shù)結(jié)合在病原檢測方面取得的進展，以期為后續(xù)探索CRISPR-Cas12a系統(tǒng)與核酸擴增技術(shù)結(jié)合后用于病原檢測提供理論參考。

1 CRISPR-Cas12a系統(tǒng)的檢測原理

迄今為止，沒有任何一種檢測方法同時符合敏感、特異、快速、操作簡單、不需復雜儀器等要求，因此，需要不斷開發(fā)新的、更有效的分子診斷方法。本文回顧了CRISPR-Cas系統(tǒng)和CRISPR-Cas12a系統(tǒng)的作用原理，討論了近幾年來CRISPR-Cas12a系統(tǒng)與PCR、LAMP、RPA及CRISPR-Cas系統(tǒng)是廣泛存在于古細菌和細菌中的一種獲得性適應性免疫系統(tǒng)[4]，由成簇的規(guī)則間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）和相關(guān)蛋白（CRISPR-associated protein, Cas）組成。根據(jù)CRISPR-Cas系統(tǒng)干擾階段效應蛋白的不同，將該系統(tǒng)分為兩大類。1類系統(tǒng)包括I、III和IV型，2類系統(tǒng)包括II（Cas9）、V（Cas12a、Cas12b、Cas14a）和VI（Cas13a）型[5-7]。2類系統(tǒng)中不同亞型的Cas蛋白靶向不同的核酸，Cas12不需要額外步驟即可直接識別靶DNA，因此Cas12常被用于DNA檢測[8]，其中Cas12a（Cpf1）的應用較為廣泛。CRISPR-Cas12a系統(tǒng)包含Cas12a蛋白和較短的CRISPR RNA（crRNA）[9]。與Cas9不同，Cas12a在將precrRNA加工成成熟crRNA的過程中不需要RNA或其他蛋白質(zhì)的輔助，也不需要RNaseIII[10]，因此Cas12a可以在tracrRNA的情況下實現(xiàn)對靶序列的切割。Cas12a通過單個crRNA識別dsDNA后，RuvC和Nuc核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域誘導非靶向鏈（NTS）和靶向鏈（TS）中的DNA交錯斷裂[11]。Cas12a在crRNA的引導下識別并解鏈富含T（TTTN）的PAM的dsDNA。解鏈后，dsDNA中的靶鏈（TS）與crRNA互補配對，引起構(gòu)象變化，暴露RuvC位點，RuvC位點先切割NTS，再切割TS，這被稱為Cas12a的順式切割活性。切割后，Cas12a-crRNA復合物保持與TS結(jié)合，并釋放切割產(chǎn)物，使仍有活性的RuvC位點暴露并與ssDNA結(jié)合而發(fā)揮反式切割活性（圖1）。因此，通過設計與靶序列互補的crRNA，可以保證Cas12a的特異性。然后，結(jié)合熒光探針或免疫層析技術(shù)，即可實現(xiàn)核酸檢測。

圖1 Cas12a-crRNA交錯切割[6]

2 CRISPR-Cas12a用于病原檢測

2.1 CRISPR-Cas12a與PCR結(jié)合用于病原檢測

PCR可在2～3 h內(nèi)擴增任何DNA片段，是常用的體外核酸擴增技術(shù)，由于其許多優(yōu)點和進一步的改進，已成為檢測、診斷和實驗室研究的基本工具。便攜式PCR熱循環(huán)儀問世以后，該技術(shù)結(jié)合CRISRP-Cas12a對多種病原的檢測工作隨即廣泛開展。其原理為PCR擴增靶序列后，crRNA引導Cas12a蛋白與靶序列結(jié)合并激活Cas12a蛋白的反式切割活性，對體系內(nèi)ssDNA報告分子進行無序切割，結(jié)合紫外燈照射或免疫層析技術(shù)即可觀察檢測結(jié)果。Li等將淬滅熒光ssDNA報告探針與PCR擴增相結(jié)合，開發(fā)了用于快速檢測靶DNA和RNA的HOLMES檢測平臺[12]。盡管樣品中未擴增的靶DNA作為激活劑，可直接用于基于CRISPR-Cas12a的核酸檢測，但其最低檢測濃度為0.1 nmol/L，而與PCR結(jié)合后，檢測濃度可低至10 amol/L。

為防止PCR擴增產(chǎn)物被氣溶膠污染，Zhang等設計了一種針對副溶血性孤菌（Vibrio parahaemolyticus, VP）的單管檢測方法，即在試管蓋內(nèi)預先加入20 μL CRISPR試劑，同時在試管底部加入25 μL PCR混合物，用50 μL礦物油覆蓋，PCR擴增后，通過離心將CRISPR試劑與PCR擴增產(chǎn)物混合[13]。該方法對VP DNA的檢出限為1.02×102拷貝/μL，且特異性高，避免污染，降低了假陽性結(jié)果的可能，因此不僅適用于病原檢測，在食品安全分析和醫(yī)學診斷等許多領域均具有應用潛力。

2.2 CRISPR-Cas12a與LAMP結(jié)合用于病原檢測

1998年，日本榮研化學株社會社設計了一種環(huán)介導等溫擴增（LAMP）DNA的方法，可在1 h內(nèi)擴增產(chǎn)生多達109個拷貝的DNA。該方法利用兩到三對引物（內(nèi)部、外部和環(huán)引物），具有較強特異性，可識別DNA或RNA靶標上多達8個特異性位點。此外，LAMP中常用的Bst DNA聚合酶的高置換活性消除了DNA的變性階段，使其可以在干燥加熱器或培養(yǎng)箱等穩(wěn)定的溫度下進行。

Lei等通過CRISPR-Cas12a與LAMP結(jié)合建立了一種針對豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的檢測方法，該方法對PCV2的檢測可以在1h內(nèi)達到1.0×100拷貝/μL的檢出限，為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征（PMWS）的預防和治療爭取了寶貴的時間[14]。研究人員還提供了在原核表達系統(tǒng)中表達huLbCas2a蛋白的最佳方案，包括溫度、時間等重要參數(shù)和使用鎳固定金屬親和色譜法洗脫純化蛋白的最佳緩沖液，這些努力不僅降低了檢測的成本，并為現(xiàn)場檢測提供了有益的參考。

Nang等開發(fā)并驗證了一種基于RT-LAMP耦合CRISPR-Cas12系統(tǒng)快速檢測丙型肝炎病毒（HCV）RNA的檢測方法，該方法的特異性為100%，對感染HCV樣品的最低檢測濃度為10 ng/μL，通過測流條帶或熒光測量觀察檢測結(jié)果，可部署在醫(yī)院檢測點，以識別HCV感染者[15]。RT-LAMP與CRISPR-Cas12a系統(tǒng)的組合通過反式切割活性進行信號擴增，提高了試驗的靈敏度。同時Cas12a-crRNA復合物可以區(qū)分核苷酸錯配，使得RT-LAMP與CRISPR-Cas12系統(tǒng)組合比單獨使用LAMP檢測更具有特異性。

2.3 CRISPR-Cas12a與RPA結(jié)合用于病原檢測

近年來，RPA技術(shù)被開發(fā)用于病原的快速檢測，由于其操作簡單，不需要復雜的設備，正在逐漸取代傳統(tǒng)的PCR技術(shù)。與LAMP相比，RPA的引物設計簡單，反應可在室溫下進行，因此RPA更適合用于病原的現(xiàn)場檢測。

Chen等將CRISRP-Cas12a與RPA技術(shù)結(jié)合，創(chuàng)立了一種被稱為DNA內(nèi)切核酸酶靶向CRISPR反式報告基因（DETECTR）的檢測方法，該方法檢測樣品中人乳頭瘤病毒（HPV）的靈敏度達到阿摩爾級，展示了從臨床樣本中檢測病毒的強大能力，為分子診斷技術(shù)提供了一個嶄新的平臺[16]；在此基礎上許多后續(xù)研究建立了更完善檢測方法，如基于RPA和Cas12a側(cè)枝切割的活性，開發(fā)了用于迅速檢測RNA和DNA標靶的HOLMES[17]。基于Chen等的設計思路，Jiang等開發(fā)了一種新的檢測VP-tdh和VP-trh基因的方法，即RPA-CRISPR-Cas12a-VP，該方法可在30 min內(nèi)準確檢測10-18mol/L的靶DNA（單分子檢測），并能準確分析濃度低至102CFU/g的樣品[18]。

在CRISPR之前進行RPA等溫擴增，可以提高檢測的靈敏度[19]，且RPA與CRISPR系統(tǒng)均在37 ℃至42℃下反應，因此可以輕易將兩者整合成功[20-21]。然而，兩個系統(tǒng)需要兩步反應，打開蓋子的中間操作可能產(chǎn)生氣溶膠污染，因此，Li等設計了單管RPA-CRISPR-Cas12a方法來快速、靈敏和無污染的檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA），并采用了3種可視化方法來呈現(xiàn)MRSA的檢測結(jié)果：實時熒光、可見終點熒光和側(cè)流條帶。整個檢測過程在15～20 min內(nèi)完成，不會因開蓋造成污染，不需要昂貴的儀器，僅需要1個小型離心機、1個熱培養(yǎng)箱和1個紫外燈就可以進行測試，其靈敏度與qPCR相當，具有應用于即時檢驗（POCT）的潛力[22]。

2.4 CRISPR-Cas12a與RAA結(jié)合用于病原檢測

重組酶輔助等溫擴增依賴于3種酶：重組酶UvsX（E. coli）、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）、DNA聚合酶。UvsX與特異性引物結(jié)合形成UvsX-引物復合物，并與基因組中的同源序列配對，配對成功后發(fā)生鏈置換反應，SSB與產(chǎn)生的置換ssDNA結(jié)合，防止立即形成dsDNA，然后通過DNA聚合酶實現(xiàn)延伸，在39 ℃下20～30 min內(nèi)完成擴增[23]。

Li等將雙鏈重組酶輔助擴增（dRAA）技術(shù)與CRISPR-Cas12a系統(tǒng)相結(jié)合，建立了一種快速、準確、靈敏、直觀的檢測嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）的方法：dRAA-CRISPRCas12a，45 min內(nèi)即可完成檢測，且該方法使用了熒光-猝滅基團標記ssDNA報告探針，借助紫外手電筒即可觀察結(jié)果，無需復雜的儀器，靈敏度與dPCR-CRISPR-Cas12a的結(jié)果一致[24]。

2.5 CRISPR-Cas12a在病原體檢測中的更多應用

CRISPR-Cas12a在病原體檢測中的更多應用如表1所示。

表1 CRISPR-Cas12a在病原體檢測中的更多應用

雖然基于CRISPR-Cas12a系統(tǒng)的病原檢測方法具有特異性強、靈敏度高、操作簡單和可與各種核酸擴增技術(shù)結(jié)合以滿足不同條件下的需求等優(yōu)點，但仍存在一些不足之處，例如：（1）CRISPR-Cas12a系統(tǒng)需要通過PAM序列來識別靶dsDNA，這樣雖然增強了靶識別的特異性，但也限制了可選擇的靶序列范圍。（2）基于CRISPR-Cas12a系統(tǒng)的檢測不易建立多重檢測方法。多重檢測方法的建立對系統(tǒng)中的Cas蛋白有嚴格要求，不同的Cas蛋白和報告基因可能會交叉切割，影響試驗結(jié)果。（3）由于CRISPRCas12a系統(tǒng)的高靈敏度，很難量化高濃度的標靶，檢測信號容易達到飽和，所以如何實現(xiàn)病原的現(xiàn)場快速定量檢測，是未來值得深入研究的方向。（4）CRISPR-Cas12a用于檢測時，通常使用兩步法，即先進行核酸擴增再進行核酸檢測，中間的操作可能會造成污染，影響試驗結(jié)果。因此，在未來，應將研究重點放在優(yōu)化核酸提取步驟、避免污染、實現(xiàn)多種病原的多重檢測和定量檢測等方面，使基于CRISPR-Cas12a系統(tǒng)的病原檢測技術(shù)在復雜環(huán)境下的性能進一步提升。

3 小結(jié)

基于CRISPR-Cas12a系統(tǒng)的病原檢測方法可達到阿摩爾級靈敏度，同時可區(qū)分核苷酸錯配，且操作簡單，適合現(xiàn)場檢測。總體而言，基于該系統(tǒng)的病原檢測方法為病原的分子檢測提供了一種新的手段，目前已初見成效且發(fā)展迅速，是新一代核酸檢測技術(shù)的重要發(fā)展方向。未來當人工智能等多種技術(shù)應用于CRISPR-Cas12a系統(tǒng)時，該系統(tǒng)將成為一種更有前景、應用更廣泛的病原檢測工具。